大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究_苗章.pdf

第 卷 第 期 年 月石河子大学学报（自然科学版）（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（）作者简介：苗章（），男，硕士研究生，住院医师，专业方向为普通外科。通信作者：张宏伟（），男，副教授，从事肝胆胰外科研究，：。：.文章编号：（）大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究苗章，程萧，满洋，林芷伊，吴向未，伍希雅，蔡克丰，崔杰，张宏伟，（石河子大学医学院，新疆 石河子；石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子；国家卫生健康委中亚高发病防治重点实验室，新疆 石河子）摘要：目的 研究细粒棘球蚴与特定浓度大肠埃希菌体外共培养的条件下活性、形态随时间的变化，以及部分参与通路。方法 将羊源性原头蚴重悬计数，分为空白组、.麦氏浓度大肠埃希菌组（实验组），并以、为时间节点，使用.伊红染液按照体积 的比例染色 后显微镜下观察并计算两组原头蚴的存活率；使用活性氧试剂盒在上述时间点检测两组原头蚴体内 水平；在、分别检测、；、蛋白的表达水平。结果 实验组原头蚴存活率随时间延长降低，在 降至为；两组原头蚴体内活性氧检测显示：实验组 水平明显提高，最高，差异具有统计学意义（.，.），在 水平与空白组相近；实验表明，凋亡蛋白（.，.）、蛋白（.，.）、蛋白（.，.），实验组的蛋白水平大于空白组，有统计学意义。抗凋亡蛋白，实验组的蛋白水平小于空白组，有统计学意义（.，.），两组 蛋白水平差异无统计学意义（.，.）。结论.大肠埃希菌在体外可以快速致细粒棘球蚴死亡，氧化应激通路可能参与了此过程。关键词：细粒棘球蚴；大肠埃希菌；活性氧（）；蛋白；蛋白中图分类号：.文献标志码：，（，；，；，）：，.（），.，；，（.，.），（.，.），（.，.），（.，.），第 期苗章，等：大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究 ，（.，.），（.，.）；（.），：；细粒棘球蚴（）所致的囊性肝包虫病是一种世界范围内流行的人畜共患病，依据肝两型包虫病诊断与治疗专家共识（版）并通过大量的临床观察，我们认为，包虫可以走向自然死亡，胆瘘和感染是两大重要因素，很多合并细菌感染的包虫囊肿会发生脓肿样改变，可发生快速死亡，引起肝包虫囊内细菌感染的主要病原菌是大肠埃希菌。本课题组实验证明大肠埃希菌在体外可以通过内质网通路导致原头蚴死亡，那么此过程是否有氧化应激、线粒体等死亡通路的参与，目前尚无确切证据，本研究延续前期实验，使用最佳.麦氏浓度大肠埃希菌与细粒棘球蚴原头蚴体外共培养，连续观察原头蚴形态学及活性的变化，并探讨氧化应激通路是否参与其中，以期为进一步研究肝包虫的自然病程提供证据。材料与方法.材料 细粒棘球蚴含细粒棘球蚴囊泡的羊肝购于新疆维吾尔自治区昌吉屠宰场；大肠埃希菌标准菌株（）来源于石河子大学医学院第一附属医院微生物室。.主要试剂 磷酸盐缓冲液（）、培养基、胎牛血清，伊红染液等购于美国 公司；、蛋白抗体购于 公司。.方法.细粒棘球蚴原头蚴的收集培养将新鲜包虫羊肝放于提前灭菌后的自来水中冲洗 遍，去除羊肝表面残留血渍及杂质，使用的酒精擦洗羊肝表面 次后抽取养肝囊泡内的囊液，并将囊液注入高压灭菌的玻璃试剂瓶中，将囊液移入超净操作台中，沉淀静置 后，去除上层囊液，再次加入 溶液后静置 ，使用注射器去除上层液体，重复 次。将收集到的细粒棘球蚴移入 离心管中，加入 溶液的将总体积定容至 ，混匀后抽取 加入同体积.伊红染液，后在显微镜下观察计算染色率。当染色率时可用于后续实验研究，如染色率大于，继续重悬、静置步骤。放入细胞培养箱中培养。每隔 更换一次培养基并使用无菌 溶液清洗原头蚴，如培养基颜色变黄则根据实际情况更换培养基。原头蚴存活率（）（未染色原头蚴个数原头蚴总和）。.观察大肠埃希菌对体外培养细粒棘球蚴原头蚴活性的影响 在、观察两组原头蚴形态及存活情况，具体如下：使用移液枪将两组观察时间点细粒棘球蚴移至 离心管，吹打混匀培养基，抽取 （约 个原头蚴）含原头蚴的培养液悬液至载玻片上，同体积伊红染液染色 ，使用显微镜观察两组原头蚴活力变化、形态结构的变化。原头蚴在活力较好的时候，不会被伊红染液染色，当期活力差或已发生死亡的时候会被染成红色。在倒置显微镜下计算原头蚴染色个数和总个数。.活性氧测定分别按照观察时间点从两组六孔板中移取适量原头蚴，放入离心管中使用 清洗重悬 次；将 与 培养基按 比例稀释，两组原头蚴分别设置阳性对照管和 管，管内加入稀释后的；阳性空白组内加入；分别将两组的阳性对照管、管孵育 ；调整离心机转速到 ，离心时间 ，去除上层液体，使用 清洗重悬原头蚴 次；避光环境下使用荧光显微镜观察原头蚴 水平，拍摄荧光图片。.检测、蛋白的表达水平 将两组六孔板中的原头蚴放入离心管，洗涤离心后加入蛋白裂解液 ，冰上裂解 后使用超声粉碎仪提取蛋白；用金属浴将加入 的蛋白变性。按 实验法依次完成电泳、电转、封闭、一抗孵育、二抗孵育、曝光。.统计学分析 计量资料以平均值标准偏差（?）表示；两组之间比较时用检验，.时表示差异有统计学意义。应用 .软件作数据统计分析，荧光图片、条带灰度采用 进行量化 石河子大学学报（自然科学版）第 卷分析，作图。结果.大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴形态的影响 不同时间点下，空白组原头蚴变化不明显，形态规则，呈椭圆形；随着时间的延长，实验组原头蚴呈外翻型，表面相对粗糙、皱缩、变形，边界不清晰，随时间延长被伊红染色的原头蚴个体数量逐渐增多，在 镜下原头蚴被全部染色（图）。.大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴活力的影响 在大肠埃希菌作用、，分别用.伊红染色，计算原头蚴的存活率。空白组的存活率 分 别 为.、.、.、.、.，实验组存活率分别为.、.、.、.、，随着时间的延长，细粒棘球蚴原头蚴活性降低，大肠埃希菌对细粒棘球蚴致死作用显著增强（图）。图 大肠埃希菌作用细粒棘球蚴原头蚴不同时间伊红染色（）图 大肠埃希菌作用细粒棘球蚴原头蚴不同时间活率曲线（）及活率比较（）.大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴活性氧（）的影响 采用 荧光探针检测不同时间两组原头蚴体内活性氧（）浓度，并使用荧光显微镜观察并拍摄荧光图片。结果显示空白组的原头蚴 浓度几乎无变化，与大肠埃希菌共培养的原头蚴体内 浓度在 前均高于空白组，在 两组 浓度近乎持平。在 后由于实验组原头蚴死亡 含量低于空白组。实验组 于 表达峰值，两组差异具有统计学意义（.，.）（图，图）。图 大肠埃希菌作用细粒棘球蚴原头蚴不同时间 含量（）图 大肠埃希菌作用细粒棘球蚴原头蚴不同时间荧光平均强度变化曲线（）及比较（）第 期苗章，等：大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究.大肠埃希菌对体外细粒棘球蚴原头蚴、；、蛋白水平的影响 由图 可知，在、检测蛋白水平，与空白组相比，不同时间点内，凋亡蛋白（.，.）、（.，.）、（.，.），实验组的蛋白表达均高于对照组，具有统计学差异。实验组的抗凋亡蛋白（.，.）表达水平明显低于对照组，具有统计学差异，实验组 蛋白（.，.）的表达水平在 高于对照组，但两组比较无统计学差异。图 检测感染组不同时间后、蛋白表达水平 讨论 大肠埃希菌是无芽孢革兰阴性短杆菌，周身鞭毛，可运动，胃肠道内多见。其在正常栖居环境中不会致病，但当进入胆囊、膀胱会引起炎症。大肠埃希菌毒力因子包括内毒素、荚膜、黏附素和肠毒素等，是引起囊性肝包虫常见并发症囊内细菌感染的主要致病菌。目前认为囊型肝包虫发生细菌感染与胆瘘紧密相关，且前期本中心术中证实部分囊型包虫内囊黄染，合并胆瘘，有文献分析为包虫囊周围肝内胆管长时间受到压迫，发生狭窄、扭曲，胆汁淤积外渗，虫囊与胆道相通，细菌随胆汁进入虫囊形成感染。课题组前期使用小鼠接种胆汁处理后的原头蚴模拟胆瘘的发生，实验发现包虫囊肿生长受到抑制，后延续实验将胆汁与原头蚴体外共培养，发现胆汁并不能直接灭活原头蚴，那么随胆汁进入囊内的大肠埃希菌能否直接杀死原头蚴？这一现象在体内很难进行单一因素观察，所以通过建立体外感染模型进行研究。结果表明大肠埃希菌可以降低体外细粒棘球蚴活性，同时活性氧（）、部分凋亡蛋白参与了此过程。石河子大学学报（自然科学版）第 卷 在细胞增殖和凋亡中起着至关重要的作用，适当较低的 水平可以作为第二信使促进细胞增殖，当机体内 水平过高时，抗氧化功能系统发生破坏，迫使细胞处于氧化应激的环境中，引起细胞损伤。有研究表明，细胞内过多 的产生，可以导致线粒体结构受损，促使细胞凋亡。本次实验中，在大肠埃希菌的作用下，细粒棘球蚴体内 快速积聚，时达到顶峰，致使细粒棘球蚴存活率降低。提示大肠埃希菌可能通过提高 的水平，影响细粒棘球蚴的活性。可以调控抗氧化应激因子表达，从而对抗氧化损伤，但有文献报道，一些毒性药物可以增强氧化应激的发生，但 的表达却是降低的。本次实验中，实验组和对照组各时间点 的表达并无统计学意义，但在第 ，实验组 表达水平是略高于对照组的，针对这一现象，本实验尚不能明确原因，其中涉及因素仍需进一步实验去证实。家族蛋白启动和执行的细胞凋亡是一种不可逆转的级联反应，在 家族中，可以通过内源性的途径激活，诱导细胞发生凋亡。在机体内，抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白 相互结合，的相对比值是调控凋亡的决定因素。本实验中，实验组不同时间点、表达均显著升高，出现下调，表明大肠埃希菌感染细粒棘球蚴后，使 发生同源活化，直接激活，导致细粒棘球蚴死亡，同时 表达增加，比值减小，促进细粒棘球蚴发生死亡。结合上述实验结果，我们可知大肠埃希菌在体外可以降低细粒棘球蚴的活性，原因可能是改变了其生存环境，同时氧化应激及线粒体通路部分相关蛋白参与了此过程。但具体哪些通路参与或者主要调节了此过程，这些都仍需更深一步研究。此外在临床观察中发现，自然状态下，病程较长的囊型肝包虫内多有钙化发生，提示包虫活性降低，彭心宇教授认为这是机体产生的一种营养不良性钙化。马志刚等研究表明囊型肝包虫病囊肿分型从 型向 型演变，胆瘘发生率增高，胆瘘可以引起囊内包虫活性转变。而囊内细菌感染与胆瘘紧密相关，因此包虫活性的降低与胆瘘、囊内感染、囊壁钙化都有着一定的联系，但是囊内细菌感染、胆瘘与囊壁钙化之间有无因果关系需要继续研究，人体内包虫囊肿自然演变受多种因素影响，是一个复杂渐进的过程，囊内细菌感染只是包虫囊肿活性降低的一种因素，肝包虫的自然病程还需要我们更全面更深层次的研究。参考文献（），（）：，（）：中国医师协会外科医师分会包虫病外科专业委员会肝两型包虫病诊断与治疗专家共识（版）中华消化外科杂志，（）：，（），（）（），（）：，：郭炜囊型肝包虫病自然病程的体外基础实验研究石河子：石河子大学，张峰，杨青，刘会苗肝包虫囊肿细菌感染病原菌分布、影像学表现及超声引导下穿刺不同处理措施对治疗疗效的影响中华医院感染学杂志，（）：，（）：杨宏强，彭心宇，张示杰，等囊性肝包虫病合并胆瘘的手术治疗中国综合临床，（）：，（）：，（）：温浩，徐明谦实用包虫病学北京：科学出版社，（）：第 期苗章，等：大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究 马志刚囊型肝包虫病合并胆瘘对其生命周期影响的研究石河子：石河子大学，郭炜，王朝阳，于云宝，等胆汁对体外培养人细粒棘球蚴原头蚴生长发育的影响石河子大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：（），（），（）：，（）：彭心宇，李建辉，赵瑾肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁钙化分布及意义中国人兽共患病学报，（）：，（）：，（责任编辑：唐慧）