丙氨酸制备研究进展_陆捷.pdf

综述与专题评论2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)299DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 032183引用格式:陆捷，王国栋，王瑞明，等 丙氨酸制备研究进展 J 食品与发酵工业，2023，49(5):299 305 LU Jie，WANG Guodong，WANG uiming，et al Advances in microbial synthesis of alanine J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):299 305丙氨酸制备研究进展陆捷1，王国栋1，王瑞明1，2，汪俊卿1，2*1(齐鲁工业大学(山东省科学院)，生物工程学部，山东 济南，250353)2(齐鲁工业大学(山东省科学院)，生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东 济南，250353)摘要丙氨酸是一种脂肪族的非极性疏水性氨基酸，是人体的非必需氨基酸，可通过身体的新陈代谢合成，根据构型，丙氨酸目前可以分为 L-丙氨酸、D-丙氨酸、DL-丙氨酸及-丙氨酸。丙氨酸目前广泛应用于食品添加剂、药品、保健品和表面活性剂等。为了避免传统工艺生产方法带来的污染等问题，丙氨酸的合成逐步被微生物发酵法及酶催化法所替代，绿色、温和、高产量的生物合成方法大大提高了丙氨酸含量的同时也为丙氨酸市场带来了发展前景。该文从丙氨酸的应用及合成方法等方面阐述了丙氨酸微生物合成的研究进展。关键词丙氨酸;微生物;合成方法第一作者:硕士研究生(汪俊卿副教授为通信作者，E-mail:wjqtt6082163 com)基金项目:国家重点研发计划(重大创新工程)项目(2019YFC1905902);山东省重点研发计划(重大创新工程)项目(2020CXGC010603，2019JZZY011003);国家自然科学基金项目(31801527);泰山产业领军人才项目(tscy20180103)收稿日期:2022-05-09，改回日期:2022-05-19丙氨酸，又名氨基丙酸，其化学式为 C3H7NO2，分子质量为8909，呈白色结晶粉末状，无毒无臭，在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚和丙醇中不溶，熔点为297，密度为 1 432 g/cm3 1 2，化学性能稳定。丙氨酸分子内包括羧基、氨基，是组成人体蛋白质结构的一类中性氨基酸。丙氨酸有 2 种同分异构体，分别为 型和 型，其中 型丙氨酸分子又存在 L 型、D 型立体镜像3，DL-丙氨酸为-丙氨酸的外消旋体。丙氨酸具有重要的生理学功能，如参与糖代谢活动，它在转氨反应中提供氨基，并参与体内的代谢循环，将氨基酸转化为糖原。化学法是生产丙氨酸的传统方法。然而，丙氨酸生产的化工流程温度高、压力大、酸碱强，环境污染严重。因此，工业化生产丙氨酸采用发酵法和微生物酶法代替了原有的化学合成法。根据目前丙氨酸的国际市场调查，丙氨酸产业在世界分布广泛，以美国、欧洲、中国为主，我国是最大的生产国，我国境内丙氨酸公司主要生产 L-丙氨酸、D-丙氨酸和 DL-丙氨酸，尽管-丙氨酸等占比较低，但发展环境较稳定，对该领域的需求也在不断增长，在未来市场非常有发展前景。1丙氨酸的应用1 1丙氨酸在食品领域中的应用在食品领域，丙氨酸是一种兼具甜味与鲜味的氨基酸，是天然的食品添加剂，是我国许可使用的 9 种增味剂之一4，可缓和酸辣苦涩等味道，柔和食品口感，提高食物营养价值，也能用于饮料中，既可以补充氨基酸的含量，也可以利用丙氨酸的碱性来降低酸度，从而调节饮料的口感。郭媛等5 研究表明，在日常饮食中加入适量的 L-丙氨酸可以让人们更容易接受豆制品和蔬菜汁的口感，降低了令人不舒服的味道，同时也提升了产品的营养价值，扩展了此类饮品的消费市场。添加 L-丙氨酸到鱼露中能有效减少含硫化合物的相对含量，改善产品风味6。L-丙氨酸和DL-丙氨酸可以使酒的味道更加醇正浓厚，增加了酒的甜味，抑制了美拉德反应，还可防止发泡酒老化，并减少酵母气味等。DL-丙氨酸还可用于改善浸渍品的风味，防止油类及油类食品氧化，提高腌制效果，同时缩短腌制的时间7。DL-丙氨酸具有缓冲酸碱、螯合重金属和抑制其他氨基酸褐化的功能。1 2丙氨酸在医药领域中的应用在医药领域中，L-丙氨酸作为营养剂和生糖氨基酸的成分之一5，可以用来检测肝脏功能，制作生物化学药剂等。也可用作术前、术后的营养剂7;L-丙氨酸作为一种原料，可用于生产多种药物，例如作为前体物质合成某些抗癌药物，用于治疗宫颈癌、喉癌等，也可以用于生产索非布韦，治疗慢性肝炎感染，及生产依那普利治疗高血压等;此外，血液保存剂中还包含 L-丙氨酸，其代谢及丰度与氨基糖苷抗生素耐药性有关8。L-丙氨酸还是维生素 B6的重要原料，食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES3002023 Vol.49 No.5(Total 473)合成氨基丙醇用来制造氧氟沙星等高效抗菌药，也可以增强吡啶酮酸等抗菌药的杀菌效果，增加细胞内活性氧的产生，起到协同抗分枝杆菌的作用，为抵抗结核病做出贡献9。结核分枝杆菌引起的结核病仍然是一个主要的全球卫生问题，结核分枝杆菌的耐药性和持久性进一步加剧了这种情况。在保健品行业，L-丙氨酸是一种护肝配方成分，可以有效地减少酒精中毒程度，还可以制成预防疲劳的营养品10;在生理医学上研究发现 D-丙氨酸能防止机体的脂质受到氧化损害。可以抑制 N-亚硝基二甲胺等致癌物质，在肿瘤细胞质中使体内的氨基酸氧化酶异位表达，从而消除细胞内的毒素，可以作为一种抗癌药物11;在制药方面，D-丙氨酸是抗生素维吉尼亚霉素系列药物的原料3，也是合成二肽阿力甜的重要原料12;D-丙氨酸在精神分裂症、阿尔兹海默症和肾脏疾病等多种人类疾病中具有相关性，为各种神经和精神疾病以及许多其他疾病的新生物标志物和治疗策略铺平道路13。-丙氨酸合成巴柳氮后可用在治疗直肠炎以及结肠炎等肠胃疾病，也可以合成泛酸钙或帕米磷酸二钠减轻肿瘤性骨痛和高血钙症。1 3丙氨酸在日化及其他领域中的应用L-丙氨酸作为温和的氨基酸表面活性剂表现出良好的去污、乳化及渗透能力，在护理品中具有美白保湿、延缓衰老等功能，更适用于敏感性肌肤，生物降解性好并且绿色环保;在化妆品中，D-丙氨酸不但有抗菌效果，而且是天然的保湿成分，起到了保持角质层水分的作用14。在用于生产新型螯合剂如甲基甘氨酸二乙酸时，L-丙氨酸避免了一些传统磷酸盐对生态系统的破坏，可以自然降解，减少了对人类和环境的损害。古户波等15 将 L-丙氨酸和鸟嘌呤组合作为原料，合成了鸟嘌呤-氨基酸衍生物缓蚀剂，具有新型、绿色和无毒性的特点。-丙氨酸晶体还可增强大肠杆菌的抑菌活性并用于废水处理16。2丙氨酸的合成2 1L-丙氨酸的合成2 1 1传统方法制备 L-丙氨酸生产 L-丙氨酸的传统制备方法主要有提取法、蛋白质水解法和化学合成法。提取法可采用酸水解或酶解法，将玉米蛋白或者明胶等 L-丙氨酸含量高的原料进行分解，再经过手性拆分可以获得 L-丙氨酸。然而该工艺成本较高，不利于大规模的工业化生产。早期在我国应用蛋白质水解法比较广，因为原料来源普遍、价格低廉，并且工艺也简单。但其生产效率低，易造成三废污染，难以在工业化生产中占有优势，目前该方法已经被淘汰。化学合成法有 3 种途径，可通过溴丙酸、氨水和碳酸氢铵混合作用，经过蒸发、去溴化铵、过滤、脱色等一系列步骤生成丙氨酸;亦可将乙醛和氢氰酸与氨反应制备氨基丙酸钠，最后采用离子交换法生成终产物;也可通过丙酸氯化法进行合成，但存在产量低、质量差和环境污染等问题，目前基本不采取该方法。2 1 2微生物发酵法合成 L-丙氨酸在大肠杆菌中 L-丙氨酸和-酮戊二酸通过谷丙转氨酶的催化生成丙酮酸和谷氨酸，且此反应为可逆反应，如图 1 所示。图 1L-丙氨酸和-酮戊二酸的转氨反应式Fig 1The transamination reaction formula ofL-alanine and-ketoglutarate虽然谷丙转氨酶可以催化 L-丙氨酸的生物合成，但其效率很低。D-乳酸、乙醇和乙酸等经由丙酮酸进一步代谢产生17，诸如此类的代谢途径与 L-丙氨酸代谢途径争夺碳源，不利于其生物合成，细胞内产生的部分 L-丙氨酸通过膜转运蛋白运输到胞外，另一部分 L-丙氨酸在消旋酶的催化下变成 D-丙氨酸，用作细胞壁的生成，ZHANG 等18 通过敲除甲基乙二醛合成酶基因(mgsA)以减少生成乳酸的途径，敲除分解性丙氨酸外消旋酶基因(dadX)以减少 L-丙氨酸到 D-丙氨酸的转化，进而提高 L-丙氨酸的产量。通过选择改善糖酵解途径以利于丙氨酸生产。结果表明，菌株 XZ132 在无机盐培养基中发酵 48 h，L-丙氨酸的产率为 95%。曹杰19 研究了以价格低廉的葡萄糖为原料发酵制备 L-丙氨酸，将丙氨酸合成的支路代谢基因 L-乳酸脱氢酶 ldh 从枯草芽孢杆菌IBL23 染色体上敲除，提升了丙氨酸产率。周丽等20 探究删除了支路代谢产物合成途径，将源于嗜热脂肪芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因 alaD 取代菌株染色体上的丙氨酸消旋酶基因 dadX，以甘油作为唯一碳源进行发酵，促进了 L-丙氨酸的合成水平。孙金凯21 在产酸克雷伯氏菌上敲除了甲基乙二醛合成综述与专题评论2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)301酶基因 mgs，并在此基础上将丙氨酸脱氢酶基因 alaD替换乳酸脱氢酶编码基因 ldh，以葡萄糖为原料，有效提升了丙氨酸的转化。潘海亮等22 研究所用的碳源是 10%混合糖(5%葡萄糖和 5%木糖)，敲除转运葡萄糖的关键基因 ptsG 以大幅减弱了葡萄糖效应，为以木质纤维素为原料制取丙氨酸奠定了良好的工业应用基础。王灿等23 研究通过敲除关键基因 ptsG 以及 mglB 抑制葡萄糖作用，采用葡萄糖 60 g/L、木糖30 g/L、水稻秸秆水解液作为碳源，提高水解液对L-丙氨酸的发酵效果。发酵法生产用到的原料葡萄糖供应充足，价格低廉，但丙氨酸的产量不高，工业化生产效率低。发酵法是当前研究的热点，随着技术的不断发展，其优越性将得到进一步的发展。2 1 3酶催化法合成 L-丙氨酸汪芳24 将来源于德阿昆哈假单胞菌中编码 L-天冬氨酸-脱羧酶的基因 aspD 克隆至大肠杆菌 BL21(DE3)中，通过诱导表达重组菌，使蛋白的可溶性表达提升。利用定点突变技术改善酶在酸性条件下的酶活力，构建组合突变株，在优化后的条件下进行全细胞转化，结果表明，突变株 N34D/L484M 在 12 h 内摩尔 转 化 率 达 99 6%，L-丙 氨 酸 生 成 速 率 为4 17 g/(Lh)。发酵转化 27 h 时，L-丙氨酸产量为371 05 g/L，摩尔转化率达到 92 3%。于佳印25 研究筛选到 Acinetobacter radioresistens 来源 L-天冬氨酸-脱羧酶(ArAsd)并通过分子改造提高 ArAsd 的酸稳定性。构建一系列突变体，其中 N35D、A179E 突变体显示出比较好的酸稳定性。构建了 ArAsd-N35D与 EcAspA 双酶偶联重组菌，通过全细胞催化底物富马酸生成 L-丙氨酸达 971 26 mmol/L，转化率为97.3%。通过表 1 对比微生物发酵法与酶催化法的国内外研究水平，可知该工艺较其他方法具有高效、绿色、环保的特点，但原料价格偏高。表 1微生物发酵法与酶催化法合成 L-丙氨酸的国内外研究水平对比Table 1Comparison of domestic and foreign research levels on the synthesis ofL-alanine by microbial fermentation and enzymatic catalysis底物方法发酵时间/h转化率产量参考文献葡萄糖敲除 mgsA、dadX4895%1 279 mmol/L 18葡萄糖敲除 ldh480685 g/L 19甘油将源于嗜热脂肪芽孢杆菌的 alaD 取代菌株染色体上的 dadX356289