丙二醛对豆粕蛋白质氧化的影响及茶多酚的缓解作用_宋娟娟.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：江苏现代农业产业技术体系建设专项资金（）作者简介：宋娟娟，硕士研究生。通信作者：周岩民，教授，博导，主要从事动物营养与饲料科学研究，：。宋娟娟，谢婷，刘文涵，等 丙二醛对豆粕蛋白质氧化的影响及茶多酚的缓解作用 南京农业大学学报，（）：，（）：丙二醛对豆粕蛋白质氧化的影响及茶多酚的缓解作用宋娟娟，谢婷，刘文涵，汪鹏，王岩，陈跃平，周岩民（南京农业大学动物科技学院，江苏 南京）摘要：目目的的 本试验旨在研究丙二醛（）对豆粕蛋白质氧化的影响以及茶多酚（）的缓解作用。方方法法 将新鲜豆粕分为 个处理组，分别采用、和、进行处理，测定豆粕中的羰基、巯基、氨基酸含量等指标。结结果果 随着 浓度的升高，豆粕中羰基含量逐渐增加（），巯基、总巯基基团、蛋氨酸、酪氨酸和赖氨酸含量和豆粕蛋白质体外消化率逐渐降低（），色氨酸内源荧光强度呈先升高后降低趋势，内源荧光 逐渐发生蓝移，且席夫碱荧光强度逐渐升高。与对照组相比，当 浓度达 时，豆粕羰基含量显著增加（），巯基和总巯基基团含量显著降低（），豆粕蛋白质体外消化率均极显著降低（）；浓度达 时，豆粕羰基含量极显著增加（），豆粕巯基和总巯基基团含量及蛋白质体外消化率均极显著降低（）；而豆粕中的蛋氨酸、酪氨酸和赖氨酸含量均极显著降低（）。添加 可减缓豆粕羰基含量的增加、巯基和总巯基基团含量的减少、蛋氨酸含量的减少、蛋白质体外消化率的下降、豆粕中色氨酸内源荧光强度的降低和席夫碱生成量的增加。结结论论 丙二醛可引起豆粕中的蛋白质氧化，造成豆粕蛋白质结构发生较大改变，蛋白质体外消化率下降，茶多酚则可有效缓解丙二醛诱导的豆粕蛋白质氧化及其体外消化率的下降。关键词：豆粕；蛋白质氧化；丙二醛；茶多酚；体外消化率中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（）（），（），（），（），（），（）（），（），（），（），：；第 期宋娟娟，等：丙二醛对豆粕蛋白质氧化的影响及茶多酚的缓解作用豆粕粗蛋白含量高、氨基酸组成均衡、营养价值高，是最重要的植物性蛋白质饲料原料，其质量直接影响饲料利用率和动物生产性能。豆粕质量受大豆品种、产地、油脂加工工艺和储存条件等多种因素影响。吴大伟等研究发现，常温储存后，豆粕中羰基含量增加，巯基含量降低，表明储存过程中豆粕蛋白质发生了氧化。氧化会降低豆粕蛋白质的消化率，从而影响其营养价值。在储存期间，豆粕中的蛋白质受到活性氧（）和脂质过氧化产物诱导、紫外光照射、金属催化和高温热处理时易发生氧化，导致蛋白质结构、生物学功能及可消化性发生变化，主要表现为形成不可溶聚集体和羰基衍生物、巯基及总巯基基团含量降低、高级氧化蛋白产物含量增加、荧光光谱改变及蛋白质消化率降低等。丙二醛（）是脂质氧化主要的次级产物之一，其分子内存在 个羰基，可通过与蛋白质之间发生共价交联影响蛋白质结构及功能性。等报道，氧化修饰降低了大豆蛋白凝胶的保水能力、凝胶硬度和强度。蒋祎人等采用 模拟氧化体系研究小分子醛类对白鲢肌原纤维蛋白结构性质的影响，发现随着 浓度的增加，肌原纤维蛋白质分子间发生了交联和聚集，蛋白质 螺旋相对含量下降，折叠相对含量上升。等研究表明，能促进兔肌肉中肌原纤维蛋白羰基化，引起其色氨酸荧光丢失，且 增强了自由基链式反应的扩增而促进蛋白质氧化。大豆中约含 的脂质，在大豆及其产品的储存、运输及加工过程中，脂质的酶促和非酶促氧化反应均会促使不饱和脂肪酸氧化产生以醛、酮等为代表的自由基，包括 等。豆粕中含有 的残余脂质，在储存过程中，豆粕中的残余脂质尤其是其中的多不饱和脂肪酸会发生氧化反应或脂质降解，而脂质氧化过程中生成的自由基及其次级产物均会引发蛋白质氧化，最终影响豆粕品质。目前，对部分植物和动物蛋白结构及功能的影响已有研究，但关于 对豆粕蛋白质氧化的影响则鲜见报道。应用抗氧化剂是控制蛋白质氧化的常见措施。等报道，植物多酚可以通过提供电子或氢原子清除自由基，从而有效控制肉制品中的蛋白质氧化。茶多酚（）是一类存在于茶叶中的多羟基酚类的混合物，主要成分是黄烷醇衍生物，俗称儿茶素，具有较强的抗氧化和清除自由基作用，作为天然抗氧化剂而广泛应用。刘慈坤等研究表明，在草鱼肌原纤维蛋白（）中添加 能够有效抑制 羰基和二聚酪氨酸的生成，增加蛋白质有效粒径和降低巯基损失。梁慧等发现，在不同氧化程度的脂肪与 建立的模拟体系中加入，羰基含量和表面疏水性的增加趋势均明显下降，而总巯基含量下降趋势明显减缓，表明 对氧化脂肪诱导蛋白质氧化有一定抑制。等报道，在含有乳清蛋白和核桃油的混合乳化液中添加 可抑制蛋白质氧化。多酚与蛋白质特殊的结构之间会发生可逆或不可逆的互作反应，且这 种反应可同时发生。多酚的抗氧化性主要是通过清除自由基，清除后其自身氧化成活性较高的半醌自由基结构或醌类物质，随后和蛋白质共价互作位点的巯基和氨基进行加成反应，生成“巯基醌”和“氨基醌”的复合物，从而导致蛋白质空间结构的改变。目前关于 的抗氧化作用已有较多研究，但有关 对 诱导豆粕蛋白质氧化的缓解作用则未见报道。因此，本研究采用 模拟氧化体系，研究 对豆粕蛋白质氧化的影响并探究 对 诱导豆粕蛋白质氧化的缓解作用，以期为深入研究豆粕蛋白质氧化及其调控措施提供参考。材料与方法 试验材料豆粕由益海（连云港）粮油工业有限公司提供，豆粕中 含量为每毫克蛋白 。，四甲氧基丙烷（）（纯度）、胰蛋白酶（来自猪胰腺，）、胃蛋白酶（来自猪胃黏膜，）、茶多酚（）（来自绿茶，纯度）购于南京安卓生物科技有限公司。试验方法 溶液制备 参照 等的方法，使用稍作修改的 酸性水解法制备新鲜 溶液。将 、和 超纯水混合，避光振荡 ，进行酸性水解，之后用 调整酸性水解液 值至，再用 （）稀释至。浓度通过分光光度计测得，测定波长为 ，摩尔消光系数为 。用时 溶液现配成 。抗氧化剂筛选 首先选用 和迷迭香酸等 种抗氧化剂进行抗氧化活性比较，通过，二苯基三硝基苯肼（）、，联氮二（乙基苯并噻唑磺酸）二铵盐（）及羟基自由基的清南 京 农 业 大 学 学 报第 卷除试验，确定 作为本试验用抗氧化剂，质量浓度为 。氧化豆粕的制备与试验设计 参照 等的方法并稍加修改制备氧化豆粕样品，用粉碎机将豆粕粉碎并过 孔径筛，利用 （）调配豆粕悬浮溶液至质量浓度为 ，并在溶液中加入 叠氮钠防止蛋白质腐败变性。试验设计共分为 组，分别为 豆粕悬浮液不同浓度 处理（、和 ）组以及 豆粕悬浮液不同浓度 处理（、和 ）组，每组 个重复样品。在 密封避光条件下振荡孵育 。反应结束后将 组豆粕样品置于冰浴中使温度快速降至 以下，随后在 去离子水中透析 ，消除未反应的 和盐。期间每隔 换 次超纯水，最终冷冻干燥 组处理后的豆粕样品，置于 保存备用。指标测定 羰基含量测定 采用 等的方法测定 个处理组豆粕样品中的羰基含量。结果以每毫克可溶性蛋白的纳摩尔羰基表示（），摩尔消光系数为 。巯基和总巯基基团含量测定 根据吴大伟等的方法，采用（，二硫硝基苯甲酸）比色法测定 个处理组豆粕样品中的巯基（包括游离的巯基及包埋在蛋白质内部的巯基）和总巯基基团（包括巯基和还原的二硫键）含量，用 的消光系数计算每毫克可溶性蛋白的巯基和总巯基基团含量（）。色氨酸和席夫碱的荧光光谱测定 参照 等的方法稍加修改，对 个处理组豆粕样品进行色氨酸和席夫碱的测定。分别将 处理后的豆粕样品粉末悬浮在 （）溶液中，在室温下搅拌 ，然后将豆粕蛋白悬液以 离心 ；收集上清液，用 蛋白检测试剂盒检测上清液中的蛋白浓度。用 调整蛋白浓度为 和 ，分别用于色氨酸和席夫碱测定。将激发波长设置为 ，记录发射光谱为 ，测定色氨酸的荧光发射光谱；将激发波长设置为 ，记录 的发射光谱，测定席夫碱的荧光发射光谱。将狭缝宽度设置为 ，以 收集数据。每个样品重复扫描 次，取平均值。氨基酸含量测定 根据 等的方法，采用全自动氨基酸分析仪测定 个处理组豆粕中的氨基酸含量。于安培瓶中精确称取 处理后的豆粕样品粉末，每组 个重复样品，分别加入 ，酒精喷灯封口，恒温消化 。室温冷却，用恒温振荡器混匀后打开安培瓶，将液体全部转移至蒸馏瓶中（清洗 次），水浴旋转蒸发去除水分及，加入 ，混匀后取 定容到，半透膜过滤后上机测定氨基酸含量。取 个重复样品测定结果的平均值即为每组豆粕样品的氨基酸含量。体外养分消化率测定采用胃蛋白酶胰酶两步消化法测定养分消化率。具体方法参照赵荣等的离体模拟消化试验法并稍加修改。胃消化阶段，分别准确称取 个处理组豆粕样品粉末 于 锥形瓶中，再加入 的（）溶液，搅拌均匀后加入 及 新鲜胃蛋白酶溶液（），调节 值至，加入 氯霉素溶液 ，封口后置于 恒温振荡 。小肠消化阶段，在恒温振荡后的溶液中加入 的 溶液（）和 的 溶液，加入 新鲜胰酶溶液（）调节 值为（用 调节），封口后 恒温振荡 。小肠结束消化后，向食糜中加入 （体积分数）磺基水杨酸溶液，室温静置 ，以沉淀蛋白质。将所有食糜转移至过滤漏斗无氮滤纸中过滤，用 磺基水杨酸将食糜残留物完全冲洗到装有滤纸的漏斗中，分别用 无水乙醇和丙酮冲洗残渣 次，烘干残渣至恒重，利用凯氏定氮仪测定粗蛋白含量。根据样品及其消化残渣中的粗蛋白含量，计算粗蛋白消化率。每个样本重复 次，取平均值。数据处理与分析试验数据经 软件初步处理后，采用 软件对数据进行分析，用 法进行单因素方差分析（）和差异显著性检验，分析 水平上的差异显著性。添加 组与不添加 组之间均数的差异性比较使用 检验。使用 软件制图。试验数据均采用平均值标准差（?）表示。第 期宋娟娟，等：丙二醛对豆粕蛋白质氧化的影响及茶多酚的缓解作用 结果与分析 丙二醛对豆粕中羰基含量的影响及茶多酚的缓解作用不同处理组豆粕羰基含量的变化见图。随着 浓度的升高，豆粕中羰基含量极显著增加（）。与对照组（）相比，当 浓度为 和 时，豆粕中羰基含量显著增加（）。而添加 的 处理豆粕组的羰基含量都显著低于相应未添加 的豆粕组（）。图 丙二醛（）及茶多酚（）处理对豆粕羰基含量的影响.（）（）与 （对照组）相比较，和 分别表示差异显著（）和差异极显著（）；与未加 组相比，和分别表示差异显著（）和差异极显著（）。下同。（），（）（）；，（）（）丙二醛对豆粕中巯基及总巯基基团含量的影响及茶多酚的缓解作用不同处理组豆粕中巯基及总巯基基团含量的变化见图。随着 浓度的升高，豆粕中巯基及总巯基基团含量逐渐降低（）。与对照组（）相比，、和 豆粕组中的巯基及总巯基基团含量均显著降低（）；而添加 的各组豆粕中巯基基团减少量都显著低于相应的未添加 组（），同时添加 和、豆粕组中的总巯基基因减少量都显著低于相应的未添加 组（）。图 及 处理对豆粕的巯基及总巯基基团含量的影响.丙二醛对豆粕中色氨酸及席夫碱内源荧光的影响及茶多酚的缓解作用随着 浓度的增加，豆粕内源荧光 呈现逐渐蓝移趋势，色氨酸荧光强度呈先升高后降低的趋势（图），席夫碱荧光强度逐渐升高（图），处理导致豆粕席夫碱生成量增加。添加 组豆粕中色氨酸荧光强度均高于相应的未添加 组（图），而添加 和 处理组豆粕的席夫碱荧光强度低于相应的未添加 组（图），可缓解高浓度（）诱导的豆粕色氨酸内源荧光强度的降低，并降低豆粕中席夫碱的生成量。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 及 处理对豆粕中色氨酸（）及席夫碱（）内源荧光强度的影响.（）（）丙二醛对豆粕中氨基酸含量的影响及茶多酚的缓解作用不同处理组豆粕氨基酸含量的变化见表。当 浓度小于等于 时，豆粕中氨基酸含量无显著差异（）；当 浓度为 时，与对照组相比，豆粕中蛋氨酸、酪氨酸和赖氨酸含量显著或极显著降低（、和）。而在 中添加 组的豆粕中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸含量及在 中添加 组豆粕中的蛋氨酸含量都显著高于相应的未添加 组（）。图 及 处理对豆粕蛋白质体外消化率的影响.表 及 处理对豆粕中氨基酸含量的影响（干物质基础）（）指标 天冬氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丙氨酸 半胱氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 组氨酸 精氨酸 脯氨酸 注：、和 表示