不同检测方法对牛奶中蛋白质含量的检测研究_王亚君.pdf

862023 年第 8 期中国饲料牛奶被定义为通过挤奶一次或多次获得的正常哺乳动物分泌物，不添加或提取任何类型的物质（Yadav 等，2015）。它是一种复杂的食物，含有丰富的营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素等。牛奶提供了一系列营养相关化合物，如酪蛋白、乳清蛋白、生物活性脂肪酸、极性脂质和其他次要成分（Fontecha 等，2017）。牛奶是新生儿的理想食物，可滋养、保护、帮助婴儿发育。牛奶及其制品具有很高的营养价值，其中，牛奶中的蛋白质为生物体提供必需的氨基酸和氮（Thum 等，2023）。由于其主要序列中存在生物活性肽，使其具有潜在的健康促进成分（张协光等，2018）。由于牛奶的各种特性，如水解时间、胶体稳定性等都会影响牛奶的最终质量，从而确定牛奶的质量特征和真实性非常重要（冯旭东，2013；Moore 等，2010）。在牛奶的所有营养素中，蛋白质含量是衡量牛奶质量的核心指标。牛奶中蛋白质含量的测定备受关注（高路，2016）。想要确定牛奶中蛋白质的含量，必须有标准的分析方法。目前，比较常见的方法包括凯氏定氮法、杜马斯燃烧法等（王钦权等，2014）。1材料与方法1.1试验原理1.1.1凯氏定氮法凯氏定氮法的原理是在高温浓硫酸中将蛋白质氧化为 CO2、H2O、NH3以及一些其他相关化合物。由蛋白质分解产生的 NH3与消解剂浓 H2SO4相结合生成（NH4）2SO4，随后进行碱蒸发，使其自由分离，H3BO3吸附，用 HCl 标准液进行滴定，按消耗的酸用量乘以换算因子转换为蛋白质含量。1.1.2杜马斯燃烧法根据杜马斯燃烧法，样品在燃烧管中的纯氧流下燃烧。富氧气体将样品中的氮元素还原为可以定量测定的 N2和 NOx。仪器正确校准后，微处理器以 g/100 g 样品给出总氮含量。1.2试验样品全脂纯牛奶，脱脂纯牛奶，发酵乳（均为市场上出售的牛奶）。1.3仪器与设备杜马斯定氮仪（格哈特公司，德国），万分之一电子天平（岛津公司，日本），全自动凯氏定氮仪，消化炉，移液枪，水浴锅，烧杯。不同检测方法对牛奶中蛋白质含量的检测研究王亚君1，刘进2，国建娜3（1.东明县市场监督管理局，山东菏泽 274500；2.鄄城县市场监督管理局，山东菏泽 274600；3.浙江浔味堂食品股份有限公司，浙江湖州 313000）摘要 在牛奶的营养成分中，蛋白质含量是衡量牛奶质量的核心指标。因此，文章探索两种牛奶中蛋白质含量的检测方法。为比较凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定牛奶中蛋白质含量的准确性，对市面上出售的 3 种牛奶样品（即全脂纯牛奶、脱脂纯牛奶、发酵乳）进行测定。并讨论了牛奶样品温度对蛋白质含量测定结果的影响，结果表明，牛奶样品的温度对凯氏定氮法、杜马斯燃烧法的蛋白质检测结果没有显著影响。随后，使用凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定了这 3 种牛奶中蛋白质含量，试验结果显示，这两种方法均能准确测定牛奶样品中的蛋白质含量，检测结果存在显著差异（P 0.05）。3 种牛奶中的蛋白质含量对比为全脂纯牛奶脱脂纯牛奶发酵乳。凯氏定氮法测定结果的相对误差均小于杜马斯燃烧法的相对误差，这表明凯氏定氮法比杜马斯燃烧法的准确度略高。关键词 凯氏定氮法；杜马斯燃烧法；牛奶；蛋白质；含量 中图分类号 TS2 文献标识码 A 文章编号 1004-3314(2023)08-0086-04DOI：10.15906/11-2975/s.20230821检 测 分 析872023 年第 8 期中国饲料1.4 试 剂 与 耗 材 硫 酸 铜（CuSO4），硫 酸 钾（K2SO4），硫酸（H2SO4），硼酸吸收液（HBO3，20 g/L），氢 氧 化 钠 溶 液（NaOH，400 g/L），甲 基 红-漠 甲 酚 绿 混 合 指 示 剂（使 用 时 按 1 g/L 溴 甲 酚绿 1 g/L 甲基红为 5 1 的比例混合），盐酸标准溶液（HCl，0.05 mol/L）。硅藻土（格哈特公司，德国），包样器（格哈特公司，德国），锡膜。1.5试验步骤1.5.1凯氏定氮法本文参考标准 GB5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定第一法凯氏定氮法。具体步骤如下：（1）消化：将 1.0000 g 牛奶样品放入定氮瓶中，加入 0.4 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾和 20 mL 硫酸，在电炉中消解，直至变为透明的蓝绿色溶液冷却，用超纯水定容到 100 mL 即可。（2）蒸馏：打开定氮设备，在水蒸气发生器中倒入 3 mL H2SO4，保持 pH，加热至沸腾，且保持沸腾。随后移取 10.0 mL 消化液到反应室，用水洗净，立即加入 10 mL NaOH 溶液，加入 10 mL HBO3作为吸收液，收集蒸馏液 10 min 后移开液面，继续蒸馏（持续时间为 1 min）。（3）除去所有馏出液，用 0.05 mol/L 的标准盐酸滴定液开始滴定，直到溶液颜色突变为蓝紫色即为结束，记录滴定结束时的体积。（4）结果计算如公式 1 所示：()100.0140100m/1000VVCXFV=（公式 1）其中，V1为牛奶样品消耗 HCl 标准溶液的量，mL；V0为 空 白 样 品 消 耗 HCl 标 准 溶 液 的量，mL；V 为移取的消化液的量，mL；C 为 HCl标准溶液的溶度，0.05 mol/L；m 为称取的牛奶样品质量，g；F 为转换/校正因子，6.25；100 为换算系数。1.5.2杜马斯燃烧法（1）准备好牛奶样品，提前预处理。（2）按照仪器说明书的指示，运行仪器，首先清除系统中的氮气（N2）。此为空白确定，旨在使仪器响应归零。仪器停止 1 h 后进行空白测定。至少进行 3 次无样本分析。空白值应稳定，必要时应将仪器调零。（3）按照仪器说明书的指示，假设仪器响应是线性的，使用已知氮含量的高纯度标准品之一分析的 10 个连续结果的平均值检查校准。平均值应在该标准参考值的 0.05%氮（0.31%蛋白质）范围内。（4）根据仪器说明书的指示，称量适量牛奶样品并放入燃烧室。注：一些更自动化的装置允许将空白、标准品和样品全部合并到自动进料器中。然后仪器通过空白、标准品和样品。计算结果前，分析员将仪器归零，校正标准，然后计算机计算结果。（5）根据制造商的指示分析测试部分。（6）将计算结果记录为 N g/100 g 样品，小数点后 2 位。（7）计算蛋白质含量 g/100 g 样品 N6.25。1.6数据统计与分析采用 Origin 8.0 对试验数据进行初步整理，用 SPSS 22.0 统计软件进行配对样本 T 检验，P 0.05 表示组间差异显著。2结果与分析2.1凯氏定氮法与杜马斯燃烧法检测结果2.1.1牛奶样品温度对蛋白质含量测定结果的影响文章探讨了凯氏定氮法与杜马斯燃烧法在牛奶样品温度为 15 40时蛋白质检测结果之间的差异。其中，牛奶样品中的蛋白质实际含量为3.09%，两种方法的测定结果如图 1 所示。由图 1可知，牛奶样品的温度对凯氏定氮法、杜马斯燃烧法的蛋白质检测结果无显著影响。因此，此后的试验均在室温下进行。2.1.2凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定牛奶中蛋白质含量结果本研究从市场上选取了 3 种牛奶（全脂纯牛奶、脱脂纯牛奶、发酵乳），分别采用凯氏定氮法与杜马斯燃烧法对其进行 3 次平行测定。由表 1 可知，3 种蛋白质的含量对比为全脂纯牛奶脱脂纯牛奶发酵乳。且凯氏定氮法测定结果的相对误差均小于杜马斯燃烧法的相对误差，这表明凯氏定氮法比杜马斯燃烧法的准确度略高。882023 年第 8 期中国饲料2.1.3凯氏定氮法与杜马斯燃烧法在其他食品中蛋白质测定的对比试验由表 2 可知，大米、鸡饲料、奶粉、豆浆和牛肉中的蛋白质含量（用凯氏定氮法测量）与用杜马斯燃烧法测量的蛋白质含量相似。这是由于这些食品的蛋白质溶解度高，蛋白质种类相对较少，特征接近于标准蛋白质溶液。表 2 大米、鸡饲料、奶粉、豆浆和牛肉中的蛋白质 含量测定结果比较%种类凯氏定氮法杜马斯燃烧法大米1.721.73鸡饲料21.021.3奶粉3.573.66豆浆0.890.91牛肉6.836.892.2凯氏定氮法与杜马斯燃烧法检测牛奶中蛋白质含量结果统计分析由表 3 可知，两种方法的数据差值为-0.03%0.00%，比值范围为99.07%100.00%，检测结果基本一致。通过SPSS 22.0 统计软件进行配对样本 T 检验，统计结果得到 P 0.05，表明两种蛋白质检测方法存在显著差异。表 3 两种检测方法对牛奶中蛋白质检测结果 的统计分析种类全脂纯牛奶脱脂纯牛奶发酵乳凯氏定氮法/%3.583.192.69杜马斯燃烧法/%3.613.222.69差值-0.03-0.030.00比值99.1799.07100.00P值0.053讨论测量牛奶中蛋白质含量最常用的方法为凯氏定氮法、杜马斯燃烧法。其中，凯氏定氮法被认为是蛋白质测量的标准方法，但其也有缺点（梁世岳等，2019）。如该方法使用了强酸、强碱等危险化表 1 凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定牛奶中蛋白质含量结果样品名称凯氏定氮法杜马斯燃烧法检测结果/%平均值标准偏差标准差相对误差检测结果/%平均值标准偏差标准差相对误差差值全脂纯牛奶3.593.580.0210.0060.01203.613.610.0250.0070.0145-0.033.563.583.603.63脱脂纯牛奶3.193.190.0150.0040.00883.223.220.0300.0090.0173-0.033.173.253.203.19发酵乳2.682.690.0300.0110.01762.702.690.0320.0120.0186-0.002.722.652.662.71注：显著性 P 均在 0.05 以下。图 1 两种方法不同温度下的测定结果892023 年第 8 期中国饲料学品，会对实验人员及环境产生潜在危险，且易存在较大的随机误差（王钦权等，2014）。杜马斯方法快速且不使用化学物质，但设备建立起来成本高昂，且不太准确，由于其也无法测量真正的蛋白质，在很大程度上限制了其大规模应用（Mhre等，2018）。通过对两种测定方法的检测结果进行比较发现，这两种检测方法具有较好的稳定性和准确性，但由于其原理不同，且进一步的试验表明，凯氏定氮法测定结果准确度较高，可以用来鉴定牛奶中的蛋白质含量。4结语综上所述，与杜马斯燃烧法相比，凯氏定氮法测定蛋白质含量的准确度略高于杜马斯燃烧法，作为常用的蛋白质检测方法之一，两种方法由于测定方法及原理之间存在差异，测定结果也存在显著性差异。但由于杜马斯燃烧法操作简单、分析快、对环境相对友好，相信其在未来蛋白质检测中可以发挥重要作用。参考文献1 冯旭东.奶制品中蛋白质的检测仪器和方法研究 D.长春：吉林大学，2013.2 高路.牛奶中蛋白质与脂肪成分含量检测仪的研制 D.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2016.3 梁世岳，李海花，陈龙宾，等.凯氏定氮法与杜马斯燃烧法检测饲料粗蛋白质含量的比较 J.中国饲料，2019，637（17）：108 111.4 王钦权，翁佳妍，黄诚等.凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定食品中蛋白质含量的比较研究 J.轻工科技，2014，30（3）：13 14.5 张协光，严虞虞，刘文丽，等.杜马斯燃烧法快速检测液体乳制品中蛋白质 J.食品科技，2018，43（1）：293 296.6Fontecha J，Jurez M.Recent advances in dairy ingredients and cardiovascular diseases with special reference to milk fat componentsJ.Dairy in Human Health and Disease across the Lifespan，2017：251 261.7Maehre H，Dalheim L，Edvinsen G K，et al.Protein Determination-Method MattersJ.Foods，2018.7（1）：5