柴胡皂苷D调节Th1_Th...耳炎的治疗作用及其机制研究_张萃.pdf

2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2柴胡皂苷D调节Th1/Th2平衡对小鼠急性中耳炎的治疗作用及其机制研究张萃1，蒋正举2，吴应玲1，丁景菊1，王胜1，谷雨，何磊1（1.六盘水市人民医院，贵州六盘水553001；2.遵义医科大学附属医院，贵州遵义563001）摘要目的：探究柴胡皂苷D对小鼠急性中耳炎的治疗作用，并探讨其可能机制。方法：采用听泡穿刺法建立急性中耳炎模型，以随机数字表法将30只急性中耳炎小鼠分为模型组、柴胡皂苷D组、联合组，每组各10只；另取10只小鼠设为假手术组。联合组小鼠腹腔注射柴胡皂苷D（2 mg/kg），尾静脉注射脂多糖Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）通路激活剂（0.58 mg/kg）；柴胡皂苷D组小鼠腹腔注射柴胡皂苷D（2 mg/kg），尾静脉注射等体积生理盐水；假手术组、模型组腹腔注射等体积生理盐水，尾静脉注射等体积生理盐水。1次/d，持续3 d。检测中耳灌洗液（MELF）炎症细胞计数、肿瘤坏死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）水平；流式细胞术检测外周血Th1、Th2构成比；Western bloting法检测中耳组织IL-33、TLR4、MyD88蛋白相对表达量。结果：柴胡皂苷D组小鼠MELF炎症细胞计数，TNF-、IL-1水平，外周血Th2构成比，以及中耳组织IL-33、TLR4、MyD88蛋白相对表达量均低于模型组，外周血Th1构成比及Th1/Th2均高于模型组，差异均有统计学意义（P0.05）；联合组小鼠MELF炎症细胞计数，TNF-、IL-1水平，外周血Th2构成比，以及中耳组织IL-33、TLR4、MyD88蛋白相对表达量均高于柴胡皂苷D组，外周血Th1构成比及Th1/Th2均低于柴胡皂苷D组，差异均有统计学意义（P0.05）。结论：柴胡皂苷D可抑制炎症反应，调节Th1/Th2平衡，从而对急性中耳炎小鼠产生治疗作用。其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88信号通路活性有关。关键词急性中耳炎；柴胡皂苷D；脂多糖；Th1/Th2；Toll样受体4；髓样分化因子88；小鼠中图分类号R285.5文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0024-04DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.005Study on the Therapeutic Effect and Mechanism of Saikosaponin D RegulatingTh1/Th2 Balance on Acute Otitis Media in MiceZHANG Cui1,JIANG Zhengju2,WU Yingling1,DING Jingju1,WANG Sheng1,GU Yu1,HE Lei1(1.Liupanshui Peoples Hospital,Liupanshui Guizhou 553001,China;2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563001,China)AbstractObjective:To explore the therapeutic effect of saikosaponin D on acute otitis media in mice,and to explore the possible mechanism.Methods:The model of acute otitis media was established by acousticvesicle puncture.30 mice with acute otitis media were randomly divided into model group,saikosaponin Dgroup and combination group,10 in each group.Another 10 mice were set as sham operation group.Thecombination group was given intraperitoneal injection of saikosaponin D(2 mg/kg),and tail vein injection oflipopolysaccharideToll-like receptor 4(TLR4)/myeloid differentiation factor 88(MyD88)pathway activator(0.58 mg/kg).The saikosaponin D group was intraperitoneally injected saikosaponin D(2 mg/kg),and the samevolume of normal saline was injected into the tail vein.The sham operation group and the model group wereinjected with the same volume of normal saline intraperitoneally,and the same volume of normal saline was injectedinto the tail vein.Once a day for 3 days.The number of inflammatory cells,the levels of tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin-1(IL-1)in middle ear lavage fluid(MELF)were detected.Flow cytometry was usedto detect the composition ratio of Th1 and Th2 in peripheral blood.Western bloting was used to detect the proteinexpressions of IL-33,TLR4 and MyD88 in the middle ear tissue.Results:The number of MELF inflammatorycells,the level of TNF-and IL-1,the peripheral blood Th2 composition ratio,and the relative expres引用：张萃，蒋正举，吴应玲，丁景菊，王胜，谷雨，何磊.柴胡皂苷D调节Th1/Th2平衡对小鼠急性中耳炎的治疗作用及其机制研究J.中医药导报，2023,29(2):24-27,34.通信作者：蒋正举，E-mail：242023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2急性中耳炎是临床常见的耳鼻喉科疾病，高发于28岁儿童，常于春冬寒冷季节发作。本病多由普通感冒或咽喉感染等上呼吸道感染引发，可发展为慢性中耳炎，造成患儿鼓膜硬化、听小骨损伤、听力下降，严重时可并发面瘫、后天性失聪及语音发育障碍1。我国超过80%儿童曾有中耳炎病史，其已成为我国公共卫生事业的长期待解决难题。抗生素是临床最常用的中耳炎治疗方案，大多数患儿可迅速痊愈，但少部分患儿因多重耐药致病菌及免疫超敏反应的影响，病情加重迁延不愈2。柴胡皂苷D是中药柴胡的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等多种生物学功效3。有学者研究认为4，柴胡皂苷D可抑制长春新碱诱导的机械超敏反应，从而治疗小鼠神经性疼痛，但目前关于其对急性中耳炎超敏反应的保护作用尚不明确。故本研究通过建立急性中耳炎小鼠模型，观察柴胡皂苷D对其的治疗作用，并探讨其相关机制。1材料与方法1.1实验动物及菌株C57BL/6J小鼠40只，SPF级，雄性，68周龄，体质量（193）g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，动物生产合格证批号：SCXK（沪）2019-0002。小鼠经耳窥镜检查均无外耳道及中耳感染。肺炎链球菌19F由六盘水市人民医院检验科提供，分离自健康儿童鼻咽部。本研究获取六盘水市人民医院动物伦理委员会批准，伦理审批号：GFRKY-20191025S。1.2药物与主要试剂柴胡皂苷D（纯度：98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：103629-72-7）；Toll样受体4（toll likereceptor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiationfactor88，MyD88）通路激活剂脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美国SIGMA公司，批号：L2630）；肿瘤坏死因子-（tumor necrosisfactor-，TNF-）试剂盒（批号：ml002859）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）试剂盒（批号：ml037361）均购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗小鼠白介素-4（interleukin-4，IL-4）-PE（批号：ab95717）、干扰素（interferon-gamma，IFN-）-PE（批号：ab83988）、IL-33（批号：ab187060）、TLR4（批号：ab22048）、MyD88单抗（批号：ab119048）均购自美国abcam公司。1.3主要仪器Infinite 200酶标仪（瑞士Tecan公司），MK 流式细胞仪（德国Luminex公司），RZ-50离心机（南京贝登医疗股份有限公司），SM2010R徕卡切片机（德国Leica公司），CX33显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。1.4动物造模取30只小鼠采用听泡穿刺法建立急性中耳炎模型。将肺炎链球菌19F菌种接种于哥伦比亚血琼脂平板，标准条件下（37，5%CO2）培养18 h，选取单个菌落转种于C+Y培养基中，培养至对数期，PBS清洗、重悬，制成浓度约为2108CFU/mL细菌悬液冰上备用。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，仰卧位固定于手术台，颈部备皮消毒，颈部腹侧切开一纵向切口，分离肌肉及结缔组织，暴露听泡壁，微量进样器吸取5 L细菌悬液，穿刺注射至两侧听泡内，完成后下压填堵穿刺口，缝合皮肤并消毒。24 h后耳窥镜观察到鼓膜充血、红肿，即表明建模成功5。30只小鼠均造模成功。1.5分组与给药采用随机数字表法将30只急性中耳炎模型小鼠分为模型组、柴胡皂苷D组、联合组，每组10只；另取10只小鼠，听泡内改为注射5 L PBS，设为假手术组。柴胡皂苷D用于人体的剂量为0.22 mg/kg（按照体质量60 kg计），根据小鼠的剂量=9.1X mg/kg（即小鼠的等效剂量相当于人的9.1倍）6，柴胡皂苷D小鼠腹腔注射剂量为2 mg/kg。LPS产品说明书中指出其作为动物实验中挽回剂时小鼠用量为0.58 mg/kg。联合组小鼠腹腔注射柴胡皂苷D（溶于生理盐水），2 mg/kg，2 h后尾静脉注射LPS（溶于生理盐水），0.58 mg/kg；柴胡皂苷D组腹腔注射柴胡皂苷D（2 mg/kg），2 h后尾静脉注射等量生理盐水；假手术组、模型组腹腔注射等量生理盐水，2 h后尾静脉注射等量生理盐水。1次/d，持续3 d。1.6组织取材干预结束第2天早晨，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，采集腹主动脉血，4 冷藏保存；采血后冰上分离切取两侧听泡及中耳组织，听泡切开并用无菌PBS灌洗3次，回收全部中耳灌洗液（middle ear lavage fluid，MELF）并混匀，部分低温离心5min（3000r/min，r=5cm），取上清液置于-80冰箱保存，用于细胞因子检测，剩余部分4 冰箱冷藏保存用于炎症细胞计数；选取相同部位中耳组织，经4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙液脱钙，常规脱水、浸蜡、包埋，切片机切为6 m厚度切片用于HE染色，另取部分中耳组织-80 冰箱冷冻保存，用于组