不同年份蕲艾酚类化合物及抗氧化活性_廖霞.pdf

北方园艺 （）：中 草 药第一作者简介：廖霞（），女，硕士，工程师，现主要从事天然产物开发等研究工作。：责任作者：詹永（），女，硕士，研究员，现主要从事中药材及健康产品开发等研究工作。：收稿日期：不同年份蕲艾酚类化合物及抗氧化活性廖霞，詹永，杨勇，罗杨，胡 柿 红（重庆市中药研究院，重庆 ；重庆市中药大健康工程技术研究中心，重庆 ；中药健康学重庆市重点实验室，重庆 ）摘要：以 年采蕲艾为试材，采用福林酚法、硝酸铝比色法分别测定总酚和总黄酮含量，通过高效液相色谱法对蕲艾提取物主要酚类成分进行定性和定量分析，采用 和 自由基清除能力评价其抗氧化活性，研究不同贮藏年份蕲艾中酚类化合物含量及其抗氧化活性差异，并阐明其对蕲艾提取物总抗氧化能力贡献情况，以期为蕲艾的开发利用及品质形成提供参考依据。结果表明：年蕲艾总酚和总黄酮含量最高，分别为 和 ，高效液相色谱法鉴定出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸和异绿原酸 种酚类物质，其中异绿原酸含量最高；年蕲艾提 取 物 抗 氧 化 活 性 最 好，清 除 和 自 由 基 的 值 分 别 为 、；种酚类成分中，绿原酸清除 和 自由基能力最强，异绿原酸对蕲艾提取物抗氧化活性贡献率最大，约为总抗氧化能力的 。不同贮存年份蕲艾酚类化合物成分和抗氧化活性均存在差异，以 年采蕲艾品质较好。关键词：蕲艾；酚类化合物；高效液相色谱；抗氧化活性；贡献率中图分类号：文献标识码：文章编号：（）艾叶（）又名艾篙，属菊科（）篙属（）植物艾的干燥叶，是一种常见的中草药，广泛分布于中国和其他亚洲国家。中医学认为艾叶辛、苦、温，归肝、脾、肾经，具有祛湿止痛、祛瘀消肿、疏通经络、温经活血的作用，有利于治疗风寒疾病、妇科疾病、呼吸系统疾病、风湿类疾病等病症。此外，由于艾草无毒、温中、逐冷、除湿等药用特性古代用于日常饮食或食疗中，数百年来艾叶一直作为传统药物或食品补充剂用于民间、现代医学、制药工业、化妆品和保健品行业。湖北蕲春所产艾叶为佳，谓之“蕲艾”，自明代以来，即被视为道地药材，含有挥发油、有机酸、黄酮类、鞣酸、萜类、大量元素及微量元素等多种活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、抗感染、保护神经等药理作用，有研究表明，蕲艾是一种潜在的廉价天然抗氧化剂来源。不同年份蕲艾叶化学成分含量有较大差异，故药材的年份直接影响药材品质。然而针对不同年份蕲艾化学成分变化的研究较少，鲜见基于蕲艾年份探讨其酚类成分和抗氧化活性差异的报道。该研究以 年采蕲艾为原料，采用紫外可见分光光度法测定其总多酚和总黄酮含量，进一步采用高效液相色谱分析蕲艾中酚类化合物成分及差异性，比较其抗氧化活性，并阐明其对蕲艾提取物的抗氧化贡献率，为蕲艾的深入研究和开发利用奠定了理论基础，同时也为研究陈艾品质的形成及其调控提供参考依据。材料与方法 试验材料供试材料和试剂：蕲艾，购自湖北蕲春；芦丁，分析纯（中国食品药品检定研究院）；、亚硝酸钠、氢氧化钠、碳酸钠、没食子酸、抗坏血酸，分析纯（山东西亚化学股份有限公司）；（美国 公司）；硝酸铝，分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；甲醇，分析纯（重庆川东化工有限公司）；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸、异绿原酸标准品（成都曼斯特生物科技有限公司）；乙酸，色谱级（西陇科技股份有限公司）；乙腈，色谱级（美国 公司）。供试仪器：紫外可见光分光光度计（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）；型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高速药物粉碎机（浙江省瑞安市环球药械厂）；分析天平（日本岛津公司）；型冷冻离心机（美国 公司）；高效液相色谱仪（日本岛津公司）。试验方法精密称取蕲艾样品粉末 （过 目筛），置于 连盖离心管中，加入 甲醇，称质量，超声提取 ，室温冷却，甲醇补足损失质量，条件下离心 ，取上清液，即得提取物溶液，冷冻保存。项目测定 总酚含量测定采用福林酚法测定总酚含量。准确称取 没食子酸，加入适量去离子水充分溶解，定容至 ，得 没食子酸溶液。用去离子水稀释成、的没食子酸标液。取 标准液加入试管中，再依次加入 去离子水、福林酚试剂，振摇试管使样品充分混合，避光保存 ，再加入 溶液和 去离子水，避光条件下放置 后于 处测定吸光度值，以多酚浓度为横坐标（），吸光度值为纵坐标（），绘制标准曲线，得回归方程：（）。取 蕲艾提取液（可作适当稀释），加入试管中，后续操作同标准曲线制备，结果以蕲艾样品中所含的没食子酸当量（）表示，以干质量计算。总黄酮含量测定采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量。精确称取芦丁标准品 ，置于 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，摇匀，即得 芦丁标准溶液。吸取上述芦丁标准溶液，用 乙醇水稀释，分别配制成、的芦丁标液。取 标准液加入试管中，分别加入 亚硝酸钠，摇匀，静置 ，再加入 硝酸铝，摇匀，静置 ，再加入 氢氧化钠、乙醇水溶液，混匀，放置 后于 处测定吸光度值。以芦丁浓度为横坐标（），吸光度值为纵 坐标（），绘 制 标 准 曲 线，得 回 归 方 程：（）。取 蕲艾提取液（可作适当稀释），置于试管中，后续操作同标准曲线制备，结果以蕲艾样品中所含的芦丁当量 表示，以干质量计算。蕲艾多酚类物质的组分分析参照等 方法并做适当修改，将蕲艾提取物和多酚标准品溶液过 有机滤膜，用于 分析。色谱条件：采用 色谱柱（，）；流动相为乙腈（）乙酸（）；流速 ；柱温；进样量；检测波长 。梯度洗脱程序：，；，；，；，；，。蕲艾提取物抗氧化活性测定）自由基清除能力测定参考 等 方法测定，配制、的样液，分别吸取 不 同 浓 度 蕲 艾 提 取 物 加 入 溶液，混匀，室温条件下避光静置 ，以抗坏血酸为对照，于 波长处测定样品的吸光度；以乙醇溶液为空白，测定其吸光度。根据式（）计算样品 自由基的清除率：自由基清除率（）（）（）。第第期期 北方园艺）自由基清除能力测定参 考 等 方 法 测 定，将 溶液和 过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜（），形 成 储 备 液。将 生 成 的 储备液用 的磷酸盐缓冲液稀释，使其在室温条件下于 波长处吸光度为 ，得到 工作液。将蕲艾提取物做相应稀释后，取 的、不同浓度样液和 工作液于 试管中，以抗坏血酸为对照，混匀后 水浴反应 ，于 波长处测定样品的吸光度；以去离子水为空白，测定其吸光度。根据式（）计算样品 自由基的清除率：自由基清除率（）（）（）。抗氧化能力贡献率的计算方法每种酚类成分对蕲艾提取物总抗氧化能力（）的贡献率，按下式（）计算。贡献率（）（）。式中：表示当自由基的清除率为 时，所需的抗氧化物质的质量；表示蕲艾中每种酚类成分的含量每种酚类成分的 值；表示蕲艾提取物多酚含量蕲艾提取物的 。数据分析采用 软件计算清除自由基的半数抑制率（值），利用 软件进行显著性分析，用 软件进行统计分析。结果与分析 不同年份蕲艾多酚类物质含量分析从图可以看出，不同贮藏年份蕲艾间多酚类物质含量差异显著（），以 年蕲艾提取物多酚类物质含量最高，总酚和总黄酮含量分别为 和 ，其次是 年蕲艾，其含量分别为 和 ，年蕲艾含量最低，分别为 和 。注：字母不同表示差异显著（），下同。：（），图不同年份蕲艾多酚类物质含量比较 不同年份蕲艾提取物中多酚类物质组分分析为进一步明确不同年份蕲艾提取物中酚类物质的组成和差异，采用 法对蕲艾样品进行定性和定量分析，混合标准品和不同年份蕲艾样品的色谱图（图）。该方法鉴定出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸、异绿原酸 共种酚酸成分，以标准品峰面积对浓度进行线性回归，得到标准 品 的回 归 方程。由表可知，年蕲艾的主要酚酸类物质含量排序为：异绿原酸异绿原酸绿原酸隐绿原酸新绿原酸，其中异绿原酸 为主要酚酸，含量分别为 、。异绿原酸、异绿原酸和绿原酸含量随贮藏年份增加呈先增加后降低趋势，且 年蕲艾提取物含量最高，分别为 、。不同年份蕲艾提取物抗氧化活性分析 自由基清除力是评价化合物抗氧化能力的常用方法之一，原理是 稳定并在 波长处有强吸收，若有孤对电子配对，吸光度降低，测得清除效果；能被氧化剂氧化生成蓝绿色阳离子，而抗氧化物质可使体系颜色退去，根据吸光度的变化可以测定抗氧化能力，值越小，说明抗氧化效果越好。由图可知，随着贮藏 年 份 增 加，蕲 艾 提 取 物 清 除 和北方园艺月月（上上）注：为混合标准品；为 年份蕲艾；为 年蕲艾；为 年份蕲艾；为 年蕲艾。：；，图混合标准品和不同年份蕲艾样品的 图 表不同年份蕲艾样品中多酚类物质含量 编号 成分 年（）年（）年（）年（）回归方程 新绿原酸 绿原酸 隐绿原酸 异绿原酸 异绿原酸 自由基能力先增加后降低，且年份间差异显著（），年蕲艾提取物清除自由基能力最 好，值 分 别 为 、，年蕲艾提取物清除自由基能力最差，值分别为 、，年和 年蕲艾提取物清除 自由基 值分别为 、，清除 自由基 值分别为 、。蕲艾提取物主要酚类成分抗氧化活性分析由表可知，在 自由基清除试验中，第第期期 北方园艺图不同年份蕲艾提取物抗氧化活性 种酚类成分清除能力排序为：绿原酸异绿原酸异绿原酸新绿原酸隐绿原酸，其中绿原酸清除 自由基能力最强，其 值为 。在 自由基清除试验中，种酚类成分清除能力排序为：绿原酸异绿原酸新绿原酸隐绿原酸异绿原酸，其中表蕲艾主要酚类成分抗氧化活性 成分 新绿原酸 绿原酸 隐绿原酸 异绿原酸 异绿原酸 清除 自由基能力最强的是绿原酸，其 值为 。不同年份蕲艾提取物主要酚类成分抗氧化能力贡献率不同年份蕲艾提取物中种酚类成分抗氧化能力贡献率顺序为：异绿原酸异绿原酸绿原酸隐绿原酸新绿原酸。异绿原酸抗氧化能 力 贡 献 率 最 大，约 为 总 抗 氧 化 能 力 的 ，其次是异绿原酸，约为总抗氧化能力的（表）。表不同年份蕲艾提取物主要酚类成分对其总抗氧化能力的贡献率 抗氧化评价方法 酚类成分 年贡献率 年贡献率 年贡献率 年贡献率 新绿原酸 绿原酸 法 隐绿原酸 异绿原酸 异绿原酸 新绿原酸 绿原酸 法 隐绿原酸 异绿原酸 异绿原酸 讨论与结论该试验以 年采蕲艾为原料，测定其总酚和总黄酮含量，通过高效液相色谱法对蕲艾多酚类物质进行定性定量分析，测定其对 和 自由基的清除能力，并分析蕲艾提取物中主要酚类成分对总抗氧化能力的贡献率。结果表明，年蕲艾提取物中多酚类物质含 量 最 高，总 酚 和 总 黄 酮 含 量 分 别 为 和 ，蕲艾在贮藏过程中多酚类物质含量，呈先增加后降低趋势，与青砖茶贮存陈化过程中多酚、茶黄素、茶红素等含量先增加后降低相同，可能与蕲艾所含药效成分和表面微生物等共同作用有关。高效液相色谱法检出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸 和异绿原酸 种多酚类物质，异绿原酸 为主要成分，异绿原酸、异绿原酸和绿原酸含量随贮藏年份增加呈先增加后降低趋势，年蕲艾提取物含量最高，与不北方园艺月月（上上）同年份河南汤阴艾叶中绿原酸含量和不同贮藏期黄连物碱成分变化趋势一致 ，这可能与中药材、中药饮片在贮藏期间受到多种因素影响有关，如湿度、温度、代谢关键酶活性等 。酚酸化合物是艾叶的主要活性成分，有抗氧化、抑制细胞凋亡、抗炎等 药理活性，绿原酸类多酚物质是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，亦具有多种生物活性，蕲艾中含有较高的绿原酸类酚类物质，可在医药、食品和化妆品等领域有较大应用前景。体外抗氧化结果表明，蕲艾抗氧化活性与贮藏年份有一定相关性，年蕲艾提取物清除 和 自由基能力最好，值分别为 、，陈荷霞等 研究发现蜜兰香型岭头单丛茶提取物抑制超氧阴离子自由基能力随贮藏年份增加而呈先增加后降低趋势，与该试验蕲艾提取物抗氧化活性变化一致。种酚类成分中绿原酸抗氧化能力最强，种评价方法评估种酚类成分的抗氧化活性结果略有不同，可能与各化学抗氧化方法原理不同有关，绿原酸类物质的酚羟基结构极易与自由基反应，具有较强的抗氧化活性。李佳银等 对甘薯茎叶中异槲皮苷和异绿原酸、这种多酚类化合物的抗氧化活性进行评估，结果表明种多酚类化合物均具有显著抗氧化能力，异绿原酸的还原能力和清除 、自由基的能力强于异绿原酸，与该试验中发现的异绿原酸抗氧化活性高于异绿原酸的结果一致。不同年份蕲艾提取物中种酚类成分对