氨基糖苷类药物检测方法的进展、应用及挑战_张清泉.pdf

书书书综述与讲座氨基糖苷类药物检测方法的进展、应用及挑战张清泉*，黄坚侯，林志强(福建医科大学附属泉州第一医院药剂科，福建泉州 362000)摘要:氨基糖苷类药物在医学临床及畜禽养殖业中广泛应用，随后导致的动物源性食品和环境中的药物残留问题严重危害动物、环境和人类健康。由于检测样本通常是混合物，且氨基糖苷类药物缺乏发光基团，同时在反相液相色谱中的色谱性能较弱，因此开发特异性高和灵敏度高的检测方法对氨基糖苷类药物的定量检测十分必要。本文综述了氨基糖苷类药物的检测方法，主要是液相色谱法和液相色谱-质谱法，详细描述了提纯、不同色谱分离以及与质谱联用的方法和相关应用，同时简单描述了适配体在氨基糖苷类药物检测中的应用，并提出了未来的挑战。关键词:氨基糖苷;检测;液相色谱;质谱中图分类号:927文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-04-0001-06作者简介:张清泉，男(1986 )。学历:硕士。职称:主管药师。从事药剂学、药物分析。通讯作者:张清泉。基金项目:泉州市科技计划项目(2018N050S)Advance，Applications and Challenges of Detection Methods for Aminogly-cosidesZHANG Qing-quan*，HUANG Jian-hou，LIN Zhi-qiang(Quanzhou First Hospital Affilliated to Fujian Medi-cal University，Quanzhou 362000，China)ABSTACT:Aminoglycosides are widely used in clinical settings and livestock，consequently resulting in drug resi-due in animal-derived food and environment，which is a serious health hazard to animal，environment and also hu-man.Given the samples are usually complex matrices，and aminoglycosides lack a chromophore and show poor chrom-atographic properties in reversed-phase liquid chromatography，thus the development of highly specific and sensitiveanalytical methods is necessary.Herein，this paper reviewed the detection methods of aminoglycosides，especially liq-uid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry，and description of extraction，chromatographic sep-aration，and tandem mass spectrometry in detail，as well as corresponding applications.Meanwhile，this paper brieflydescribed the application of aptamer in aminoglycosides detection and provided challenges in the future.KEY WODS:Aminoglycosides;Detection;Liquid chromatography;Mass spectrometry氨基糖苷类药物是一类可对抗革兰阳性菌和革兰阴性菌的广谱抗菌药物，其历史可追溯至 1944 年 Waksman 首次发现的链霉素1。氨基糖苷类药物主要由链霉菌属(Streptomy-ces)和小单孢子菌属(Micromonospora)细菌产生，其中前者产生的药物后缀为“mycin”，后者产生的药物后缀为“micin”。此外，如地贝卡星(dibekacin，1971)、阿米卡星(amikacin，1972)、阿贝卡星(arbekacin，1973)、异帕米星(isepamicin，1975)及奈替米星(netilmicin，1976)为半合成氨基糖苷类药物2。他们的主要结构为氨基环醇和 2 个或更多氨基糖组成，由糖苷键相连，其中氨基环醇骨架有两种:streptamine 和deoxystreptamine(见图 1)。该类药物的具体化学结构、抗菌活性以及相应的耐药性均已在此前报道的综述中充分描述2。图 1链霉素和氨基糖苷类药物核心结构2氨基糖苷类药物虽然具有耳毒性和肾毒性，但由于其价格低廉疗效好，因而在医学临床和兽医养殖领域广泛使用，但同样也造成了环境中药物残留及相应耐药性产生的问题3。对该类药物的检测受限于其缺乏发光基团而无法直接通过紫外吸收的方式测量。其他诸如利用脉冲电流探测器(Pulseeamperometric detectors，PAD)、蒸发光散射检测器(Evaporativelightscattering detection，ELSD)以及串联质谱(Tandem massspectrometry，MS/MS)的液相质谱法已有一些应用。然而，这1Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.4 2023些方法所要求的仪器设备昂贵，且操作复杂，在经济相对弱后的地域不容易应用。于此，本综述拟对目前已有的氨基糖苷类药物检测分析方法进行归纳总结，并提出相应的挑战以及未来的发展前景。1提纯检测药物的浓度首先需要从相关样品中提取并纯化氨基糖苷类药物，其常规步骤包括混匀、酸剂或有机溶剂析出蛋白、机械振荡或超声处理释放药物、分离沉淀和液相、固相萃取柱(Solid-phase extraction，SPE)提取、脱脂以及浓缩等。从肌肉、牛奶以及肾脏(鸡、猪、马、牛等)中提取氨基糖苷类药物的经典方法包括 4 个主要步骤:利用含有三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)和 EDTA 的溶剂提取;利用SPE 纯化;利用蒸发法浓缩上一步处理后的洗脱液;用小体积溶剂复溶4。具体步骤如下:添加 10 mL 提取液(2%TCA 和 0.1%Na2EDTA2H2O)至样品中，涡旋混匀后超声处理 5 min 并将上清液收集至 15 mL 小瓶中;使用如 Chroma-bond H-X 等萃取柱(先用 5 mL 甲醇、5 mL 水和 5 mL 提取液调节)对上一步的提取液进行纯化;使用 1 mL 水对萃取柱进行清洗，并将萃取柱自然风干 30 min;随后用 6 mL 甲醇进行洗脱，用氮吹仪在 40 下进行浓缩;沉淀物使用 0.5 mL 或1 mL 水复溶后转移至聚丙烯(Polypropylene)材料制成的液相色谱小瓶4。其步骤中利用聚丙烯材料代替玻璃可有效减少玻璃表面对药物的吸附作用，最终药物回收率可达 94%至103%4。许多研究者对此方法进行了改良，如在 SPE 材料方面利用了弱阳离子交换的羧丙基 SPE5、阳离子交换柱(BakerBond SPE Wide Pore CBX)6、来自 Supelco 公司的DSC-WCX 萃取柱7、以及湍流预柱(Turbulent-flow pre-col-umn)(TurboFlow Cyclone P)8等。Martos 等报道了使用 CH3CN/H2O(8614，v/v)萃取和己烷脱脂从牛肉中提取链霉素、庆大霉素 C1、新霉素 B、阿米卡星和卡那霉素等氨基糖苷类药物，以及其他抗生素的方法9。医学临床应用中，氨基糖苷类药物从血浆中提取的方法主要有两种，蛋白沉析和 SPE。前者使用有机溶剂或酸剂进行蛋白沉析，并通过超高速离心以及浓缩复溶后进行分析，其中常用的蛋白沉析试剂有乙腈10，11、甲醇12、三氯乙酸13以及七氟丁酸14。使用 SPE 时，溶剂的选择取决于 SPE 的类型，洗脱液蒸发至干以及复溶通常在流动相中进行。经典的例子是使用 IsoluteCBA carboxylate weak cation exchange SPE(100 mg，3 mL)(Mid Glamorgan，UK)从血浆中提取氨基糖苷类药物，萃取柱首先用2 mL 甲醇和2 mL H2O-NH3(25%)(100.1，v/v)进行调节，然后将血浆样品与水 11 稀释后添加到萃取柱上，再使用甲醇进行清洗并晾干，最后使用 1.0 mL H2O-TFA(10 0.1，v/v)溶液进行洗脱15。另有研究使用 OasisMCX 萃取柱(30 mg，1 mL)(Waters，Milford，MA，USA)对血浆中 6 种氨基糖苷类药物进行提取，萃取柱首先用 1 mL 甲醇和1 mL 水进行调节，然后将混合 9%甲酸(5050，v/v)的样本添加至萃取柱上，再使用50%甲醇和9%甲酸清洗，最后用50%甲醇和 20%氨洗脱，并在 70 晾干后复溶至流动相中16。2液相色谱法由于缺乏发光基团，紫外及荧光检测将不能使用，然而通过光化学方法如 PAD、电喷雾质谱(Electrospray ionization massspectrometry，ESI-MS)、ELSD 以及电荷气溶胶检测(Chargeaerosol detection，CAD)可以达到检测的目的。其中 ESI-MS、ELSD 和 CAD 需要使用挥发性的流动相添加剂，包括挥发的离子对试剂(Ion-pairing agents，IPs);PAD 则需要在上柱后添加 NaOH 调节 pH 至 12。由于氨基糖苷类药物的高极性特点，在使用反相液相色谱(eversed Phase Liquid Chromatogra-phy，PLC)时，pH 适当的溶液中质子化的药物不容易存留，而离子对液相色谱(Ion-pair liquid chromatography，IPLC)和亲水作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HIL-IC)可解决上述问题。2.1离子对液相色谱在该方法中，IP 是一类携带大片段疏水基团的分子，该基团可与 PLC 的固定相反应，而离子端则携带与分析产物相反的电荷，常被添加到流动相中。烷基磺酸盐(Alkyl sulfonates)化合物常被用作 IP，然而当使用ESI-MS 检测时必须使用全氟烷基乙酸，如三氟乙酸(Triflu-oroacetic acid，TFA)至七氟丁酸(Heptafluorobutyric acid，HF-BA)。烷基链长度的增加将增加药物在溶液中的存留，己烷磺酸盐在短时间内表现最佳的分离效果。过高的 IP 浓度(20 mM)将损坏 PLC 的柱子，因此需要在达到处理需求的同时尽可能保持较低的 IP 浓度。附加的缓冲液系统常用于 IPLC 中以控制流动相的 pH和分析物的质子迁移水平，其中乙酸盐和磷酸盐最为常见。利用 IPLC 对新霉素和新霉素 B 以及相关物质进行分离时，使用 170 mM 的 TFA 作为 IP 以及 ELSD 检测能够检测到药物制剂中 0.20%(m/m)的杂质17。使用含有 11.6 mM HFBA作为 IP 的 C18柱(水-丙酮，5050 作为流动相)可以从药物制剂中检测到最低 0.6 gmL1的新霉素18。2.2毛细管电泳Huidobro 等使用含有 35 mM 磷酸盐和15 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.7)的水性背景电解质、聚丙烯酰胺涂层的熔融石英毛细管和 200 nm 的紫外光来测定软膏中的新霉素19。Yang 等使用 125 mM NaOH 作为背景电解质、未涂覆的熔融石英毛细管和包含铜