6种植物精油体外抗肿瘤活性研究_张辉.pdf

6 种植物精油体外抗肿瘤活性研究张辉1，徐端妙1*，林秀君1，陈莉娟1，刘浩凯2（1.景宁畲族自治县生态林业发展中心，浙江 景宁 323500；2.景宁县畲族自治县自然资源和规划局，浙江 景宁 323500）摘要：为了探究 6 种植物精油的抗肿瘤活性，选择 6 种柏科植物日本花柏（Chamaecyparispisifera）、日本扁柏（C.obtusa）、细叶花柏（C.pisifera Plumoso）、台湾扁柏（C.obtusa var.formosana）、罗汉柏（Thujopsis dolabrata）和日本冷杉（Abies firma）作为原料，采用水蒸气蒸馏技术提取植物精油，以植物精油作为油相，以吐温 80 为表面活性剂、乙醇为助表面活性剂制备 O/W型微乳体系。采用 MTT比色法检测 6 种精油对 HepG2、A549 和 U937 等 3 株肿瘤细胞株的增殖抑制作用。实验结果显示：6 种精油对 HepG2、A549 和 U937 肿瘤细胞株的增殖均显示抑制作用，其中日本扁柏叶精油抑制 3 株肿瘤细胞的增殖作用比较明显。因此，6 种植物精油具有较强的抗肿瘤活性，具有潜在的开发应用价值。关键词：植物精油；抗肿瘤；微乳体系doi：10.3969/j.issn.2095-3801.2023.02.007中图分类号：S763.306.4文献标志码：A文章编号：2095-3801（2023）02-0043-05On Antitumor ActivityofSixPlant Essential Oils in VitroZHANGHui1，XUDuanmiao1*，LINXiujun1，CHENLijuan1，LIUHaokai2（1.Ecological ForestryDevelopment Center ofJingningShe Autonomous County,Jingning323500,Zhejiang;2.Natural Resources and PlanningBureau ofJingningShe Autonomous County,Jingning3235000,Zhejiang）Abstract：To investigate anti-tumor activity of the essential oils from 6 plants,six plants including Chamaecyparispisifera.C.obtusa.C.pisifera Plumoso.C.obtusa var.Formosana had been chosen.Thujopsis dolabrata and Abies firma were used as raw materials,essential oil was extracted by steam distillation.The O/W microemulsionsystem was prepared with plant essential oil as oil phase,Tween 80 as surfactant and ethanol as cosurfactant.MTTassay was used to investigate the inhibitory effect of essential oils on the proliferation of HepG2,A549 and U937cell liness.The results showed that the six essential oils had inhibitory effects on the proliferation of HepG2,A549and U937 tumor cell lines,among which the essential oil from C.obtusa had a better inhibitory effect on the threecells significantly.Therefore,6 kinds of plant essential oils have anti-tumor activity and potential development andapplication value.Key words：essential oils;antitumor;microemulsion system收稿日期：2022-09-30；修回日期：2022-10-23作者简介：张辉，男，浙江丽水人，工程师，硕士。通信作者：徐端妙，男，浙江景宁人，工程师。丽 水 学 院 学 报JOURNAL OF LISHUI UNIVERSITY第 45 卷第 2 期Vol.45No.22023 年 3 月Mar.2023天然产物在癌症预防和治疗中发挥着重要作用，目前临床上使用的抗肿瘤药物中有相当一部分是天然来源的。例如，在 20 世纪 40 年代至 2006年间，国际上批准的所有抗癌处方药中，有一半以上是天然产物或其衍生物。从天然化合物中发现新型抗肿瘤活性成分越来越受到关注1-2。植物精油是一类具有特殊芳香气味的且含有单萜、倍半萜等物质的天然挥发性混合物，挥发油成分因其广泛的生物活性而引起了人们极大的兴趣和关注。例如，黄连木的挥发性成分与体外抑制结肠癌、前列腺癌和肺癌有关3-4。丽水市景宁畲族自治县草鱼塘森林公园 20 世纪 60 年代开始开展高山引种试验，经几十年生长，现有特色人工林日本扁柏、台湾扁柏、罗汉柏、日本花柏等高山柏木林 1 293 亩，日本冷杉177 亩，本文选取 6 种特色针叶植物作为研究对象，采取水蒸气蒸馏方法提取精油，并制备 O/W型微乳体系，研究植物精油抗肿瘤活性，探索高山针叶林生物资源的开发利用途径。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1试验材料日本花柏叶（Chamaecyparis pisifera）、日本扁柏叶（C.obtusa）、细叶花柏（C.pisifera Plumoso）、台湾扁柏（C.obtusa var.formosana）、罗汉柏（Thujopsisdolabrata）和日本冷杉（Abies firma）采集于丽水市景宁畲族自治县草鱼塘森林公园。1.1.2试验设备细胞培养皿和 6 孔/12 孔/96 孔细胞培养板（NEST公司）；倒置显微镜（DMi8，德国徕卡公司）；-80 立式超低温冰箱、二氧化碳培养箱（ThermoScientific Forma 900，美国赛默飞世尔公司）；植物精油提取机组（JYJ-10LJ，上海矩源自动化科技有限公司）；离心机（5805CM364673，德国 Eppendorf公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）；酶标测定仪（美国伯腾仪器有限公司）；高压灭菌锅（日本 Hirayama 公司）；电子天平（ME203E/02，梅特勒托利多仪器有限公司）。1.2实验方法1.2.1植物精油的制备将新鲜采集的 6 种植物新鲜枝叶，分别取 500g置于植物精油提取装置，按液料比 15 加入蒸馏水，水蒸气蒸馏 2 h，收集挥发油部分，加二氯甲烷萃取 3 次，自然挥发二氯甲烷，以无水硫酸钠进行干燥，得黄色透明油状物即植物挥发油。1.2.2植物精油微乳体系的制备各取 100 L 日本花柏精油（CPO）、日本扁柏精油（COO）、细叶花柏精油（PSO）、台湾扁柏精油（CTO）、罗汉柏精油（TDO）和日本冷杉精油（AFO）作为微乳油相，加入 5%的混合表面活性剂（吐温80 与乙醇体积比为 51），充分混匀后加入 900 L的 DMEM培养基，即得到 10%微乳液，将其作为母液，过滤除菌，再用完全培养基稀释成 0.1、0.5、1 L/mL 三个浓度。1.2.3肿瘤细胞培养复苏：取出冻存的肿瘤细胞，立即放入 37 恒温水浴锅中进行水浴，同时不停摇晃，待冻存管内的物质呈液体状态时取出，放入超净工作台，取出离心管，加 5mLPBS，反复吹打后将冻存管内剩余细胞悬液加入离心管里，吹匀后放入离心机 1000r/min 离心 5min。离心后在超净工作台内操作，倒掉离心管内的上清液，装到 1 个培养皿（10 mL）内，放入37、5%CO2培养箱内培养一段时间。贴壁细胞（HepG2、A549、U937）选用的是 DMEM完全培养液，悬浮细胞 PC12 选用的是 RPMI1640 完全培养基。显微观察：用倒置显微镜观察细胞生长情况，当观察到细胞长势良好，且长满整个培养皿约80%时，即可进行传代。冻存：用倒置显微镜观察培养皿中细胞生长情况，当观察到细胞长势良好，且长满整个培养皿约80%时，即可进行冻存。贴壁细胞弃去培养皿中的丽 水 学 院 学 报2023 年44完全培养液，用 PBS缓冲液洗涤 2 次，加入 1 mL胰蛋白酶消化酶解 3 min，加入终止液使消化终止，吹打混匀并吹落培养皿残留的细胞，将收集的细胞1 000 r/min 离心 5 min，弃上清。悬浮细胞 PC12 可以先转移至离心管中进行离心，弃上清。离心后再在离心管中加入 700 L培养液，吸打混匀后转入冻存管，加入 200 L 血清和 100 L DMSO，混匀，封管，置于程序性冻存盒，于-80 冰箱中保存。1.2.4抗肿瘤细胞活性评价采用 MTT法测定 6 种精油对 3 种癌细胞的抑制率5-6。取对数生长期细胞用 0.25%胰蛋白酶消化后，用培养液稀释。在 96 孔培养板中每孔加入 200L（每 mL含有 5 000 个肿瘤细胞）含 10%FBS 的DEME 完全培养液，细胞置于 37，10%CO2培养箱中培养 24 h 后，实验组分别加入 100 L 含0.01%、0.05%、0.1%精油的培养液培养，空白对照组则加入等体积溶剂的培养液，每组 5 孔，置37，10%CO2培养箱中培养 20 h 后，弃上清液，加入 200 L/孔新鲜配制的含 0.2 mg/mL MTT 的无血清培养液，37继续培养 4 h，弃上清液，加入200 L DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长570 nm测定 OD 值，重复 3 次，按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。肿瘤细胞生长抑制率=（1-实际组平均 OD值对照组平均 OD值）100%。2结果2.1植物精油对 A549 细胞株增殖作用影响由图 1 可知，当精油浓度为 0.1 L/mL 时，CTO 对 A549 细胞抑制率最高；当精油浓度为0.5 L/mL 时，COO、PSO、CTO、TDO 对 A549 细胞的抑制率均接近 100%；在最大浓度为 1 L/mL时，6 种植物精油对 A549 细胞抑制率均接近100%。2.2植物精油对 HepG2 细胞株增殖作用影响由图 2 可知，当精油浓度为 0.1 L/mL 时，AFO对 HepG2 细胞抑制率最高；当精油浓度为 0.5L/mL 时，COO、PSO、CTO、TDO 对 HepG2 细胞的抑制率均接近 100%；在最大浓度为 1 L/mL 时，除 CPO 外，其他精油对 HepG2 细胞抑制率均接近100%。图 16 种植物精油对 A549 细胞株增殖的抑制0.1 L/mL0.5 L/mL1 L/mL抑制率/%150100500CPOCOOPSOSTOTDOAFO张 辉，徐端妙，林秀君，等：6 种植物精油体外抗肿瘤活性研究第 2 期452.3植物精油对 U937 细胞株增殖作用影响由图 3 可知，当精油浓度为 0.1L/mL时，PSO对 U937 细胞抑制率最高；当精油浓度为 0.5 L/mL时，CPO、AFO、PSO、CTO 对 U937 细胞的抑制率均接近 100%；在最大浓度为 1 L/mL时，除 COO外，其他精油对 U937 细胞抑制率均接近 100%。图 26 种精油对 HepG2 的抑制活性图 36 种精油对 U937 的抑制活性0.1 L/mL0.5 L/mL1 L/mL抑制率/%150100500CPO