创新霉素生物合成研究进展_侍媛媛.pdf

.343.创新霉素生物合成研究进展侍媛媛 武临专 洪斌*(中国医学科学院 北京协和医学院 医药生物技术研究所，国家卫健委抗生素生物工程重点实验室，中国医学科学院药物合成生物学重点实验室，北京100050)摘要：创新霉素是中国科学家20世纪60年代发现的具有全新骨架结构的抗生素，由济南游动放线菌产生，具有良好的抗菌活性和新颖的作用靶点，但创新霉素的生物合成基因簇在其发现50多年后才得到解析。本文介绍了创新霉素研究的历史沿革，着重介绍了其生物合成机制的最新研究进展，从生物合成基因簇、生物合成途径、新颖的去泛素化酶样的硫转移酶催化的硫掺入机制、罕见的细胞色素P450酶催化的C-S键形成机制等角度进行阐述，这些研究进展为利用组合生物合成和合成生物学技术进行新药研发和高产优产奠定了理论基础。关键词：创新霉素；生物合成；C-S键形成；硫掺入；细胞色素P450酶中图分类号：R978.1 文献标志码：AResearch progress on the biosynthesis of chuangxinmycinShi Yuan-yuan,Wu Lin-zhuan,and Hong Bin(NHCKeyLaboratoryofBiotechnologyofAntibiotics,CAMSKeyLaboratoryofSyntheticBiologyforDrugInnovation,InstituteofMedicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100050)Abstract ChuangxinmycinisanantibioticisolatedfromActinoplanes tsinanensisinthe1960swithanovelindole-dihydrothiopyranheterocyclicskeleton.Itshowedgoodantibacterialactivityanduniqueantibacterialmechanism.However,itsbiosyntheticgeneclusterhasremainedobscureforover50years.Thehistoricalevolutionofchuangxinmycinresearchwasintroduced,andthelatestadvancesintheunderstandingofitsbiosyntheticmechanismwerereviewedindetailfromtheperspectivesofbiosyntheticgenecluster,biosyntheticpathway,thenovelmechanismforsulfurincorporationcatalyzedbyadeubiquitinase-likesulfurtransferaseandtherareC-SbondformationmechanismcatalyzedbycytochromeP450enzyme.Theelucidationofthebiosyntheticmechanismofchuangxinmycinprovidesthebasisforapplyingcombinatorialbiosynthesisandsyntheticbiologytechnologyingeneratingdiversestructuresfornewdrugdiscoveryanddevelopment.Key words Chuangxinmycin;Biosynthesis;C-Sbondformation;Sulfurincorporation;Cytochrome P450 enzyme收稿日期：2021-08-26基金项目：国家重点研发计划(No.2018YFA0902000)；国家自然科学基金(No.81872780和No.81803410)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(No.2018-I2M-3-005)和北京市自然科学基金(No.7184227)作者简介：侍媛媛，女，生于1990年，博士，助理研究员，研究方向为微生物次级代谢产物生物合成与合成生物学。E-mail: *通讯作者，E-mail:综 述1964年，中国医学科学院医药生物技术研究所(前身为中国医学科学院抗菌素研究所)从我国山东济南土壤中分离得到的一株放线菌3945-64(后命名为济南游动放线菌，Actinoplanes tsinanensis CPCC 中国抗生素杂志2023年3月第48卷第3期文章编号：1001-8689(2023)03-0343-08DOI:10.13461/ki.cja.007474.344.200056)1 中筛选发现了创新霉素(1)，当时的代号为抗5。创新霉素的结构母核为吲哚骈二氢噻喃环，是一个全新的杂环体系(图1)。创新霉素在体外对多种革兰阴性菌和阳性菌有抑菌作用，与常用抗生素和抗菌药之间无交叉耐药性，药理试验证明创新霉素毒性较低、副作用小。20世纪70年代进行了初步临床试验，结果表明创新霉素对大肠埃希菌等细菌感染引起的败血症、尿路感染、胆道感染和婴儿腹泻等有一定疗效，有效率达78%1-2，是我国发现并自行研制的第一个全新结构骨架的抗生素。1976年在中国科学杂志上正式报道了创新霉素3，同年，梁晓天等4报道了创新霉素的化学结构，张致平等5完成了消旋创新霉素全合成；后来陆续发表了其晶体结构6和绝对构型7，并且发现只有天然构型的创新霉素才具有抗菌活性8。创新霉素可以选择性抑制细菌色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)的活性9，目前临床上还没有在用的针对此靶点的抗生素，在当前抗生素耐药问题日益严重的形势下，基于创新霉素结构骨架的新药研究将具有新的意义。自创新霉素发现开始，其独特的化学结构和良好的抗菌活性就引起了药物化学家的极大兴趣，开展了大量的化学合成研究4-8，其中在创新霉素C-2羧酸上形成取代苯甲酰氧甲酯或环己基甲酰氧甲酯前药有利于提高抗革兰阳性菌活性10，但化学合成获得的创新霉素结构衍生物大多数抗菌活性并不理想10-15。构效关系研究发现，在创新霉素四种立体异构体中，仅(2R,3S)-创新霉素具有抗菌活性8,15，并且C-3位的甲基对其活性是必需的16-17。在生物合成方面，20世纪70、80年代对创新霉素生物合成中硫原子的来源、甲基化等做了初步的探索18-20，其后30年间基本未见生物合成相关研究报道。直至2016年武临专课题组报道从创新霉素产生菌中分离得到3-去甲创新霉素(2，图1)17，生物活性测定表明其抗菌活性显著降低，与早期化学合成的结果一致21，其后创新霉素生物合成研究陆续报道。本文对目前创新霉素生物合成研究取得的进展进行总结，从生物合成基因簇的确定、生物合成途径的解析、新颖的S掺入机制、罕见的C-S键形成机制等角度进行阐述，这些研究为创新霉素生物合成过程中酶学机制的阐明，以及利用组合生物合成和合成生物学进行新药研究和高产优产奠定了理论基础。1 创新霉素生物合成基因簇的确定创新霉素被发现50多年来一直未有其生物合成基因的相关报道。1989年曹兢和戚天庆在创新霉素产生菌中发现了吲哚丙酮酸甲基转移酶的活性20，推测可能与创新霉素的C-3甲基化有关，但并未克隆其基因。直至2018年，洪斌、武临专课题组和张友明、卞小莹课题组先后报道了创新霉素的生物合成基因簇并推测了其生物合成过程22-23。基因簇定位的策略是在测定创新霉素产生菌的全基因组序列的基础上，根据创新霉素生物合成过程的逆分析推测可能参与其生物合成的基因，寻找到可能的基因簇，再通过异源表达、基因阻断与回补等进行确证。由于创新霉素与吲哚霉素都是色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)的抑制剂，借鉴吲哚霉素通过抗性基因TrpRS锁定其生物合成基因簇这一思路24，在创新霉素产生菌全基因组序列寻找TrpRS，发现了2个同源基因，其中一个抗性基因所在的基因簇含有甲基转移酶、氨基转移酶以及与初级代谢S掺入相关的硫携带蛋白，还含有一个调节基因和转运蛋白，故将基因簇定位于此，全长约11 kb，共包含10个基因(图2)，而后通过调节基因过表达和基因簇的异源表达及生物合成基因cxnD的阻断确证该基因簇负责创新霉素的生物合成22-23。2 创新霉素生物合成途径的解析对创新霉素生物合成基因簇中10个基因分别进行体内阻断分析，ats4177/cxm9、cxnA/cxm8、cxnD/cxm5、cxnE/cxm4和cxnF/cxm3基因阻断后不再产生创新霉素，而抗性基因trpRS/cxm0、转运蛋白CxnT/Cxm2分别被阻断后，创新霉素的合成未受明显影响23。当调控基因cxnR/cxm1被阻断后，创新霉素不再产生23；图1 创新霉素及去甲创新霉素的化学结构Fig.1 Chemical structures of chuangxinmycin(1)and 3-demethylchuangxinmycin(2)NHSCOOHNHSCOOH12345678910111213Chuangxinmycin(1)3-demethylchuangxinmycin(2)NHSCOOH创新霉素生物合成研究进展 侍媛媛等.345.而在产生菌中过表达cxnR/cxm1时，创新霉素产量显著提高22，提示cxnR/cxm1是创新霉素生物合成途径特异性的正调控基因。最近，报道了细胞色素P450酶CxnD/Cxm5的C-S键形成催化功能和分子机制25，张伟、李盛英和卞小莹、张友明团队报道了S的掺入机 制26。根据这些实验结果，创新霉素生物合成途径已基本阐明(图3)。2.1 C-3位甲基的合成CxnA/Cxm8推测是一个依赖于VB12的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)超家族的C-甲基转移酶，当cxnA/cxm8、ats4177/cxm9分别阻断后，创新霉素均消失，而去甲创新霉素产量提高23。为了验证CxnA与Ats4177的功能，将去甲创新霉素分别饲喂到仅表达CxnA、Ats4177与共表达CxnA-Ats4177的菌株中，发现只有在共表达菌株中去甲创新霉素(2)可以被转化为创新霉素(1)23；将生物合成基因cxnB-F进行异源表达产生去甲创新霉素(2)，而只有将cxnA和ats4177同时导入该菌株时才能产生创新霉素(1)25，这些结果表明甲基转移酶CxnA需要Ats4177的辅助才能完成甲基化，这在次级代谢产物的甲基化反应中是比较罕见的。Ats4177与分子伴侣PqqD27在三维结构上具有较高的同源性，PqqD是一种结构保守的肽伴侣蛋白，可以与编码自由基SAM家族的酶PqqE形成复合物从而参与或影响其功能，所以推测Ats4177可能与PqqD具有相似的功能，它与CxnA相互作用参与甲基化这一过程的机制值得进一步探究。2.2 起始反应CxnB/Cxm7编码氨基转移酶，与吲哚霉素生物合成中的Ind8、thienodolin生物合成中的ThnJ具有高度的相似性，Ind824和ThnJ28-29均已被证实可以催化L-Trp转化为吲哚丙酮酸，是这两个化合物生物合成的起始反应。生化实验证明CxnB/Cxm7确实可以催化L-Trp的氨基转变为酮基26。但是当CxnB被阻断后，创新霉素的合成在异源宿主中未受明显影响，推测这是由于异源宿主Streptomyces coelicolor A3(2)中含有CxnB同源蛋白，可以提供功能补偿23。2.3 第一个C-S键的形成S的掺入作为位居碳、氢、氧、氮和磷之后的第六大元图2 创新霉素的生物合成基因簇及基因功能22-23Fig.2 Gene organization of chuangxinmycin biosynthetic gene clusters in the cxn and cxm locus and predicted function of each