不同生长状态祁连圆柏针叶内生真菌群落结构与多样性分析_方泰军.pdf

第 37 卷第 4 期干旱区资源与环境Vol 37No 42023 年 4 月Journal of Arid Land esources and EnvironmentApr 2023文章编号:1003 7578(2023)04 170 08doi:1013448/j cnki jalre2023100不同生长状态祁连圆柏针叶内生真菌群落结构与多样性分析*方泰军，白露超(青海大学农牧学院，西宁 810016)提要:为掌握西北干旱地区祁连圆柏内生真菌群落结构以及多样性，探索内生真菌与祁连圆柏针叶生长状态的联系，通过高通量测序技术对健康和枯黄的圆柏针叶进行了分析。研究结果显示:6 组样品测序共得到 2，338，753 条有效序列，683 个操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)。ACE、Chao1、Shannon 指数表明发病组样品的物种丰富度与多样性略高于健康组。门分类水平上，两组样品的优势菌群均为子囊菌门，在属分类水平上，枝孢属 Cladosporium 是健康组样品中的优势属，球腔菌属 Mycosphaerella 是发病组样品中的优势属。在群落结构组成上，健康组样品中枝孢属 Cladosporium、球腔菌属 Mycosphaerella、丝状担子菌属 Filobasi-dium 相对丰度均高于发病组，组成占比也较为均匀，发病组样品中除 Mycosphaerella 之外其余属真菌占比均较低，没有明显的层次结构。Beta 多样性显示 6 组样品大致分为两个分布区，各样品组间差异较小，两组样品差异较为明显。属分类水平上大多数属间呈正相关，负相关主要集中球腔菌属 Mycosphaerella、Zymoseptoria、achicladosporium 等属，这几个属在发病组中的丰度均高于健康组样品。关键词:祁连圆柏;高通量测序;内生真菌;群落结构中图分类号:Q949 3文献标识码:A植物内生真菌(Fungal endophytes)是指存在于健康植物组织中，其生活史的某一阶段或全部阶段都在植物的各组织、器官内度过，而不使其宿主植物表现出明显感染症状的一类真菌1。1993 年 Stierle 等人从短叶红豆杉中分离到1 株可以产生紫杉醇的内生真菌2，人们逐渐发现内生真菌对提高植物抗病、抗盐碱以及抵御干旱的能力有着重要作用3。在内生真菌与寄主长期的协同进化过程中，植物为其提供必需的营养，而内生菌则通过自身的代谢产物或自身存在对宿主产生影响，形成一种平衡稳定的互利共生关系4 6。但是在植物生长过程中，当外界环境发生变化或者受生物因素影响后，这种平衡关系可能会被打破，导致某些菌群过度生长，植物内生真菌群落结构以及多样性随之发生改变7。谢宪8 等通过高通量测序对健康和发病的不同状态赤松针叶进行了内生真菌多样性与群落结构差异分析，健康针叶中优势属为多臂菌属和暗色球菌属，发病针叶优势属主要为薄盘菌属。祁连圆柏(Juniperus przewalskii)是我国特有树种，主要分布于我国青藏高原东北部海拔 2800 4000m的高山阳坡地带9。该树种耐寒、耐旱、耐盐碱对土壤条件要求较低，是西北高寒干旱地区重要的乔木树种之一，在水土保持和水土涵养等方面发挥着重要作用10。目前，针对祁连圆柏的研究主要集中在播种育苗11、病虫害防治12、树轮气候学13、衍生产品化学成分14 等方面，与微生物多样性相关的研究较为缺乏。近年来，青海省麦秀国家森林公园内出现祁连圆柏针叶大面积枯黄现象，课题组在进行病原菌分离鉴定后并没有分离得到相关的病原菌。在全球气候变暖的背景下，青藏高原增温愈发明显15，干旱等极端气候事件也显著增加16，该地区生态环境也在逐渐发生变化。植物体内生真菌群落结构受气候因素影响。在此初步推测圆柏叶枯是一种由外界环境变化造成内生真菌群落失衡导致的病害。文中通过高通量测序对两种不同状态下的祁连圆柏针叶进行分析，首次揭示祁连圆柏针叶内生真菌*收稿日期:2022 11 24;修回日期:2023 1 31。基金项目:青海省“昆仑英才高端创新创业人才”项目;青海省科技成果转化专项(2023 SF 119)资助。作者简介:方泰军(1995 )，男，硕士研究生，研究方向为林木病理学。E mail:1169546019 qq com通讯作者:白露超(1986 )，女，博士，副教授，主要从事林木病理学研究工作。E mail:250861678 qq com群落结构组成以及多样性变化，为进一步研究祁连圆柏针叶枯黄的原因以及祁连圆柏与内生真菌之间的关系提供了一定的理论依据。1材料与研究方法1 1样品采集与处理样品于 2022 年 8 月份采集自麦秀国家森林公园(10146 10204E，358 3521N)天然林区。在该林区选择 3 个采样点，采样点之间间距大于 10km，在各采样点选择树龄约为 80 年健康和枯黄未死亡的圆柏作为采样植株，每株采集一份当年生针叶作为测序样品。健康组样品命名为 J1、J2、J3，发病组样品命名为 F1、F2、F3。采集后的样品装入无菌塑封袋中用冰盒保存带回实验室进行表面消毒处理，具体方法如下:在超净工作台中依次将样品浸入 75%乙醇 1min，5%次氯酸钠 5min，最后无菌水冲洗并用滤纸吸干水分，消毒完成后将样品装入 10ml 离心管 20冰箱保存备用。图 1健康(A)与发病(B)祁连圆柏Figure 1 Healthy(A)and morbidity(B)Juniperus przewalskii1 2样品 DNA 提取、扩增及测序将表面消毒后的样品采用 CTAB 法进行基因组 DNA 提取，使用引物 ITS1(5 TCCGTAGGTGAACCT-GCGG 3)和 ITS4(5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3)进行 ITS 片段扩增，扩增片段大小为250 400bp。PC 反应体系(50l)为:2x Premix Taq 25l，引物 ITS1 和 ITS4 各 1L，DNA 模板 50ng，ddH2O 补加至 50L。PC 扩增反应条件为:94预变性 5min，94变性 30s，52退火 30s，72延伸 30s，30 个循环;72再延伸 10min，4保存。PC 产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳检测，有明亮条带后将纯化后的扩增产物送往百迈克生物公司进行测序，测序数据量不小于 6w 序列数。1 3测序数据分析测序后的数据使用 FLASH v1 2 7 软件，通过 overlap 对每个样品的 reads 进行双端拼接后得到原始序列(aw Tags)，用 Trimmomatic v0 33 软件，对拼接得到的 aw Tags 进行过滤，得到优化序列(CleanTags)，用 UCHIME v4 2 软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到有效序列(Effective Tags)。最后通过 Usearch软件对 Tags 在 97%的相似度水平下进行聚类，获得 OTUs(Operational Taxonomic Units)。使用 Mothur(version v 1 30)软件，对样品 Alpha 多样性指数进行评估，其中包括 Chao1 指数、Ace 指数、Shannon 指数和覆盖度(Coverage)。Chao1 和 Ace 指数表示物种丰富度，数值越大表示群落物种越丰富，Shannon 指数表示物种多样性，数值越大物种多样性越高，覆盖度(Coverage)表示测序覆盖度，数值越高表示样品中物种被测出的概率越高。使用 QIIME 软件进行 Beta 多样性(Beta diversity)分析，比较不同样品在物种多样171第 4 期方泰军等不同生长状态祁连圆柏针叶内生真菌群落结构与多样性分析性方面存在的相似程度。2结果与分析2 1测序数据基本情况6 个样品测序共获得 2，608，835 对 eads，双端 eads 质控、拼接后共产生 2，338，753 条 Clean eads，GC 含量位于 46 83%54 81%之间，Q30 含量大于 98 43%，有效序列数占原始序列数超过 89 32%。各样品在 97%的相似度水平下进行聚类分别获得 333、306、353、371、312、376 个 OTU，其中健康组于发病组共有 OTUs 数为 414 个，健康组特有 OTUs 数为 138 个，发病组特有 OTU 数为 131 个(图 2)。稀释性曲线可以反映测序深度以及物种丰富度，由图 3 稀释性曲线可知，随着测序条数的增加，稀疏曲线急剧增加，随后逐渐趋于平缓，说明测序结果包含绝大多数物种信息，但仍有少量物种待发掘。表 1 各样品测序数据Table 1 Sequence data of each sample样品编号原始序列数有效序列数GC 含量(%)Q30(%)Effective(%)OTUs 数J1544920492802478498589044333J2543376491687468398579049306J3479660429430489398638953353F1457231416426518498729108371F2236760211468548198678932312F3346888296940535298438960376图 2发病组和健康组 OTUs Venn 图Figure 2 OTUs Venn diagram for the morbid and healthy groups图 3Alpha 指数稀释性曲线图Figure 3 arefaction curves of alpha index for six samples2 2物种多样性分析如表 2 所示，6 个样品覆盖度均大于 99 9%，测序结果合理可反应样本中实际真菌种类和群落结构。2 组样品 ACE、Chao1、Shannon 指数如图 4所示，由图 A、B、C 可知 F 组样品 ACE、Chao1、Shannon 指数略高于 J 组，说明祁连圆柏针叶在发病枯黄后，其内生真菌多样性和丰富度均高于健康针叶。表 2 Alpha 多样性指数统计Table 2 Alpha diversity indexesSample IDCoverageACEChao1ShannonF1099987982147564000036111F2099966293198460166737054F3099986471621451471454637J1099996142952417285731791J2099995826214487166743473J30999975972955200714381442 3群落组成分析利用 QIIME 软件对两组样品 OTUs 在门(phylum)纲(class)目(order)科(family)属(genus)等分类水平上进行注释分类，结果显示祁连圆柏内生真菌共涉及 5 个门，22 个纲，49 个目，107 个科和 147 个属。在门分类水平上(图5)，健康组样品在门分类水平有子囊菌门 Ascomycota、担子菌门 Basidiomycota、被孢霉门 Mortierellomycota、油壶菌门 Olpidiomycota;发病组样品注释到的门有子囊菌门 Ascomycota、担子菌门 Basidiomycota、被孢霉门 Mortierellomycota 和球囊菌门 Glomeromycota。其中子囊菌门 Ascomycota 在健康271干旱区资源与环境第 37 卷图 4Alpha 多样性指数 A、B、C 分别为 ACE，Chao1，Shannon 指数Figure 4 Alpha diversity indexes of morbid and healthy groups A:ACE index，B:Chao1 index，C:Shannon index图 5内生真菌群落组成分布(门水平)Figure 5 Composition and distribution o