医学实验室高端仪器设备标准操作规程_李力钟艳平主编.pdf

医学实验室高端仪器设备标准操作规程主 编 李 力 钟艳平副主编(按姓氏笔画为序)何 敏 吴 华 谢 莹 臧 宁 黎丹戎编 者(按姓氏笔画为序)韦世录 左文朴 成晓静 李卫东 李 刚 李洪涛 郑 华 林 兴 周 怡 雷丹青 廖共山 廖 明广西科学技术出版社责任编辑：林坚 封面设计：韦娇林责任校对：文秋鸾 责任印制：韦文印出 版 人：韦鸿学 出版发行：广西科学技术出版社社址：广西南宁市东葛路 6 6 号 邮政编码：5 3 0 0 2 2网址：h t t p:/w w w.g x k j s.c o m经销：广西新华书店发行印刷：广西大华印刷有限公司地址：南宁市高新区科园大道 6 2 号 邮政编码：5 3 0 0 0 7开本：7 8 7 m m 1 0 9 2 m m 1/1 6字数：3 1 0 千字 印张：1 4.8 7 5版次：2 0 1 5 年 6 月第 1 版 印次：2 0 1 5 年 6 月第 1 次印刷书号：I S B N 9 7 8-7-5 5 5 1-0 4 3 5-3定价：4 5.0 0 元版权所有侵权必究质量服务承诺：如发现缺页、错页、倒装等印装质量问题，可直接向本社调换。医学实验室高端仪器设备标准操作规程主编李力钟艳平图书在版编目（C I P）数据医学实验室高端仪器设备标准操作规程/李力，钟艳平主编南宁：广西科学技术出版社，2 0 1 5.6I S B N 9 7 8-7-5 5 5 1-0 4 3 5-3.医 .李 钟 .医学检验医疗器械技术操作规程 .R 4 4 6 T H 7 7 6中国版本图书馆 C I P数据核字（2 0 1 5）第 0 9 4 2 1 5 号前言后基因组时代生物医学的迅速发展，与生命科学的进步息息相关。今天的生命科学已不仅仅是描述性、实验性的科学，定量科学成为了必然趋势，没有对生命各类生命现象的精确测量，便难以对生命过程进行全方位的调控与干预，而精确测量就完全要依靠分析测试仪器，所以医学实验仪器是医学科学研究的重要支撑条件。近年来，质谱仪、测序仪、动物活体成像设备、激光共聚焦显微镜、双光子显微镜、流式细胞仪、电子显微镜、超高速离心机等一系列大型精密仪器为研究生物大分子的结构和功能提供了定位、定性、定量甚至实时的数据和多维的图像，也为分子生物学、细胞生物学领域的重大发现提供了强有力的设备支撑。通过这些大型仪器采集的数据和图像成为每一篇生命科学论文中最重要和核心研究结果，诠释着生命现象的复杂本质，引领着相关研究领域的发展方向。对生物医学研究中的大型仪器设备的开发利用和规范的管理，是对生命各类生命现象进行精确测量的根本保证。标准操作程序（s t a n d a r d o p e r a t i o n p r o c e d u r e，S O P）是仪器管理中常用的一种标准的作业程序。S O P在这里为“最优化”的概念，是经过不断实践总结出来的在当前条件下可以实现的最优化的操作程序设计。本书由多年承担广西医科大学研究生和本科生的科学研究指导和实验仪器设备正确使用技能培训的老师撰写，不仅详细介绍了医学实验室常见大型仪器使用的 S O P，而且结合大型仪器在医学中的应用，详细介绍了检测实例，体现了编写者对相关仪器设备的了解和熟悉，更是编写者对开发利用大型仪器的宝贵经验的分享。因此本书既可作为科学实验仪器设备学课程培训的教材，提供如何正确使用相关实验仪器设备的教程，更是医学实验室管理和生物医学科学研究有价值的参考书。医学实验室高端仪器设备的开发利用和科学管理，需要具备较好的医学、生物学、数学、计算机科学、信息学等多学科知识和掌握实验仪器设备正确使用方法。由于编写人员理论水平和实验经验有限，书中难免存在不足之处，还望读者提出批评和改进意见，以便今后进一步修订提高。编者 2 0 1 4 年 1 0 月 2 2 日目 录1目 录第一章N i k o n A 1激光扫描共聚焦显微镜系统 1第一节仪器操作规程 1第二节采用激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化 5第三节激光共聚焦显微镜动态观察大黄素-环糊精包合物在细胞内的分布 7第四节应用激光共聚焦显微镜动态观察药物对细胞内钙离子浓度的影响 12第二章L e i c a D M6 0 0 0 B全自动染色体图像分析系统 1 5第一节仪器操作规程 15第二节人淋巴细胞（外周血）培养及染色体制备 19第三章Z E I S S P A L M激光捕获显微切割系统 2 4第一节仪器操作规程 24第二节LCM 联合基因芯片在肿瘤差异表达基因研究中的应用 27第三节LCM 结合 SELDI-TOF-MS 技术筛选肿瘤差异表达蛋白质 31第四章V E G A 3 L MU扫描电子显微镜 3 4第一节仪器操作规程 34第二节VEGA 3 LMU 扫描电子显微镜含水标本制备及观察 37第三节VEGA 3 LMU 扫描电子显微镜不含水标本制备及观察 40第四节利用 VEGA 3 LMU 扫描电子显微镜能谱分析功能分析精液元素成分 42第五章H-7 6 5 0透射电子显微镜 4 5第一节仪器操作规程 45第二节常规透射电子显微镜生物样品制备与观察 48第三节悬浮液样品的负染色制备与观察 53医学实验室高端仪器设备标准操作规程2第四节应用免疫电子显微镜胶体金技术定位裸鼠神经元细胞内蛋白 56第六章E P C 1 0膜片钳操作系统 6 0第一节仪器操作规程 60第二节大鼠心室肌细胞动作电位及钙、钠离子通道电流的检测 65第七章B D I n f l u xT M流式分选系统 6 9第一节仪器操作规程 69第二节肿瘤细胞中 SP 细胞流式分选 75第八章岛津 L C-6 A D高效液相色谱仪 7 9第一节仪器操作规程 79第二节应用高效液相色谱分离脑组织中的氨基酸 84第九章B i o L o g i c D u o F l o w P a t h f i n d e r 2 0/8 0中高压层析系统 8 9第一节仪器操作规程 89第二节应用 BioLogic DuoFlow Pathfinder 20/80 System 纯化五步蛇毒 97第十章O d y s s e y 红外成像系统 1 0 1第一节仪器操作规程 101第二节Odyssey 红外成像系统用于 Western Blotting 后膜信号扫描 105第十一章B i o-R a d双向电泳及其图像扫描和分析系统 1 1 0第一节仪器操作规程 110第二节二维电泳技术用于细胞来源的蛋白分离 131第十二章表面增强激光解析电离飞行时间质谱仪 1 3 6第一节仪器操作规程 136第二节应用 SELDI-TOF 质谱仪进行血清样品的差异分析 141第十三章E s q u i r e 4 0 0 0电喷雾线性离子阱质谱仪 1 4 7第一节仪器操作规程 147第二节用线性离子阱质谱仪鉴定血清白蛋白 149第十四章T e mp o L C MA L D I 纳流液相系统 1 5 2目 录3第一节仪器操作规程 152第二节应用 Tempo LC 分离多肽混合物 159第十五章MA L D I-T O F/T O F基质辅助激光解析质谱仪 1 6 2第一节仪器操作规程 162第二节iTRAQ 结合 MALDI-TOF/TOF 筛选和鉴定血清标志蛋白 167第十六章A B I 3 1 0 0遗传分析系统 1 7 4第一节仪器操作规程 174第二节应用 ABI3100 测序系统的 SNaPshot 多重分型技术研究 IL-1B-1473基因多态性（SNP）177第十七章i S c a n芯片扫描系统 1 8 1第一节仪器操作规程 181第二节应用 iScan 芯片扫描系统进行全基因组外显子区 SNP 位点扫描 183第十八章A B I 7 5 0 0荧光定量 P C R系统 1 9 2第一节仪器操作规程 192第二节应用 ABI7500 荧光定量 PCR 系统检测 rs12624116 基因单核苷酸多态性 195第十九章Q I A G E N P y r o Ma r k Q 9 6 I D焦磷酸测序系统 2 0 0第一节仪器操作规程 200第二节应用 QIAGEN PyroMark Q96 ID 焦磷酸测序系统检测 rs94489 基因多态性 202第二十章B i o-R a d B i o P l e x 2 0 0悬浮液相芯片系统 2 0 6第一节仪器操作规程 206第二节应用 Bio-Rad BioPlex200 悬浮液相芯片系统检测血清中甲胎蛋白（AFP）209参考文献 2 1 5中英文对照 2 2 2第一章N i k o n A 1 激光扫描共聚焦显微镜系统1第一章Ni k o n A 1 激光扫描共聚焦显微镜系统第一节仪器操作规程一、仪器的基本原理激光扫描共聚焦显微镜（L a s e r S c a n n i n g C o n f o c a l M i c r o s c o p e，L S C M）采用激光作为光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与图像信号收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，即可获得样品某一焦面的平面图。若调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息通过计算机叠加、分析和模拟，可显示细胞样品的立体结构。传统的光学显微镜使用的是场光源，样本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；而激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对样本内焦平面的每一点扫描，样本上的被照射点在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（P M T）或冷电耦器件（c C C D）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合稳定完美对焦系统可以实现长时间活细胞动态观察。二、仪器的结构激光共聚焦显微镜主要由激光光源、全自动显微镜、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集、数字信号处理和转换、应用软件）、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统组成（图 1-1）。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。医学实验室高端仪器设备标准操作规程2（注：电动倒置荧光显微镜；共聚焦显微镜扫描头；共聚焦显微镜总控制器；光谱探测模块；检测器；电源开关；激光器开关；遥控操作系统；共聚焦显微镜工作站+检测器）图 1-1 激光共聚焦显微镜（一）显微镜光学系统倒置荧光显微镜是 L S C M的主要组件，它关系到系统的成像质量。物镜的转换、滤色片的选取、载物台的移动调节、焦平面的记忆锁定都由计算机自动控制。（二）扫描装置L S C M使用的扫描装置一般为镜扫描。通过计算机控制的步动电动机带动显微镜移动，以实现在同一焦平面上的逐点扫描；或通过沿 Z 轴方向逐渐改变焦平面，来完成对样品不同层面的扫描；亦可对细胞或组织厚片进行类似 C T断层扫描的无损伤连续光学切片，经过计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。（三）激光光源L S C M使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，常用的激发波长为 4 0 5 n m、4 8 8 n m、5 4 3 n m和 6 3 3 n m。（四）检测系统L S C M为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏第一章N i k o n A 1 激光扫描共聚焦显微镜系统3度高的光电倍增管（P M T）。P M T前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满