手性毛细管电泳实验中手性选择剂取代度的影响研究_谢天尧.pdf

Univ.Chem.2023,38(1),187191 187 收稿：2022-02-12；录用：2022-03-24；网络发表：2022-04-08*通讯作者，Email: 基金资助：中山大学实验教学研究(改革)项目 化学实验 doi:10.3866/PKU.DXHX202202025 手性毛细管电泳实验中手性选择剂取代度的影响研究手性毛细管电泳实验中手性选择剂取代度的影响研究 谢天尧*，邓爱玲，肖华，朱芳 中山大学化学学院，广州 510275 摘要：摘要：针对手性毛细管电泳实验“手性药物氧氟沙星对映体的分离检测”的教学过程中，发现手性选择剂取代度对实验结果具有重要影响，详细研究了一系列不同取代度的羟丙基-环糊精对氧氟沙星对映体分离效果的影响。研究结果表明：对映体的分离度随取代度变化显著，且取代度DS=7.9时分离度最佳。依据取代度的测定方法，对市售羟丙基-环糊精的质量进行评估，以确保手性毛细管电泳实验结果的稳定性和良好的教学效果。关键词：关键词：手性毛细管电泳实验；取代度；手性药物分析；羟丙基-环糊精；氧氟沙星；仪器分析实验 中图分类号：中图分类号：G64；O657 Study on the Influence of the Substitution Degree of Hydroxypropyl-Cyclodextrin in Chiral Capillary Electrophoresis Experiments Tianyao Xie*,Ailing Deng,Hua Xiao,Fang Zhu School of Chemistry,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510275,China Abstract:Because of the important influence of the chiral selector substitution degree on the enantioseparation of ofloxacin in chiral capillary electrophoresis experiments,the effects of the substitution degree of hydroxypropyl-cyclodextrin(HP-CD)on the inclusion complex between ofloxacin and HP-CD were investigated according to different substitution degrees.The results showed that the enantioseparation resolution changed significantly with the substitution degree.Moreover,the best separation resolution was found for a DS(degree of substitution)=7.9.The methods of determining DS were also discussed.Using these methods,the quality of commercial hydroxypropyl-cyclodextrin products can be effectively monitored,and the stability and effectiveness in teaching of the chiral capillary electrophoresis experiment can be ensured.Key Words:Chiral capillary electrophoresis experiment;Substitution degree;Chiral drugs analysis;Hydroxypropyl-cyclodextrin;Ofloxacin;Instrumental analysis experiment 当药物分子结构含有手性中心时，由于空间构型的不同就可以得到结构上互为镜像的一对分子，成为对映异构体。手性药物对映体在人体内往往显示出不同的生理和药物治疗效果，通常只有一种有药理活性，另外一种活性很弱，或没有活性，甚至有毒副作用1,2。由于对映体的化学组成、理化性质均完全相同，用一般的方法难以得到分离，因此手性药物对映体分离检测方法是分析化学研究的热点和难点之一3,4。手性毛细管电泳具备分离效率高、试剂消耗少、环境友好、分析成本低等特点，在手性化合物的分离分析中极具应用前景5,6。由于手性毛细管电泳的运行和维护成本较低，从根本上解决了在实验教学中开展手性药物对映体分离检测存在的实验费用昂贵问题。为此，我们“仪188 大 学 化 学 Vol.38器分析实验”教学小组在科研成果基础上7，设计开发出“毛细管电泳/非接触式电导分离检测手性药物氧氟沙星对映体”的实验教学内容，并应用于我院本科生的实验教学8,9。该实验理论与实践相结合，采用了熟知的市售手性药物氧氟沙星，且学生能够亲自动手操作毛细管电泳仪器进行手性药物对映体的分离检测，深受学生欢迎。氧氟沙星(Ofloxacin)是常见的喹诺酮抗菌类药物，在临床上有着广泛的应用。氧氟沙星属于手性药物，存在2个对映体分子(S-ofloxacin，R-ofloxacin)。羟丙基-环糊精结构式中含有多个手性中心并略呈锥形的中空圆筒立体杯状结构10。其外缘亲水而内腔疏水，由于其独特的结构特性使其作为主体可以选择性地与合适的客体分子形成包合物。这种选择性的包络作用即通常所说的分子识别。羟丙基-环糊精的空腔结构与氧氟沙星分子结构匹配，能够形成稳定的包合物，如图1所示。由于羟丙基-环糊精与氧氟沙星的2个对映体分子之间所形成的包合物具有不同的稳定常数，在手性毛细管电泳中其电泳淌度将会表现出显著差异，进而可采用毛细管电泳-非接触式电导法(CE-C4D)实现氧氟沙星对映体的良好分离和灵敏检测。图图1 羟丙基羟丙基-环糊精与氧氟沙星的包合反应环糊精与氧氟沙星的包合反应 在教学实践过程中，我们发现所采用的手性选择剂羟丙基环糊精除了浓度对氧氟沙星对映体的分离效果存在显著影响外，还存在着取代度的影响。这是以前被忽略而没有引起重视的一个较为重要的因素。具体表现为不同品牌、不同产家，甚至是同一产家在不同时期所提供的羟丙基环糊精，虽然商品名称相同但对氧氟沙星对映体的分离效果存在显著差异，造成实验结果的异常波动，影响了实验教学效果。经查阅文献资料，并反复试验，最终确定引起对映体分离效果异常波动的主要原因是手性选择剂羟丙基环糊精的取代度不同所造成。为此，本文系统研究了不同取代度的羟丙基环糊精对手性药物氧氟沙星对映体的分离度影响，寻找出最佳取代度的羟丙基环糊精。同时依据取代度的测定方法，提出对市售羟丙基环糊精质量的评估方法，以确保手性毛细管电泳实验结果的稳定性和取得良好教学效果。1 实验部分实验部分1.1 实验仪器与试剂实验仪器与试剂毛细管电泳仪(配备非接触式电导C4D检测器，广州涵天科仪公司)；石英毛细管柱(50 m id.，邯郸永年锐沛色谱器件公司)；台式高速离心机(湖南湘仪公司)。乙酸、乙酸钠、NaOH、HCl(广州化学试剂厂)；氧氟沙星对照品(中国计量科学研究院)。不同取代度(DS=4.1，6.2，7.9，9.1)的羟丙基-环糊精(HP-CD)购自化学试剂公司。所用试剂除注明外均为分析纯。水为超纯水。市售左旋氧氟沙星和氧氟沙星片剂(或者是滴眼液)购自广州市当地的药店超市。电泳运行液用时现配。质量浓度为100 mgL1的氧氟沙星对照品标准储备液，保存在4 C的冰箱中。实验时，取适量的上述标准品储备液用超纯水配成不同浓度的标准工作溶液。1.2 样品处理样品处理市售氧氟沙星药片(包括左旋体和外消旋体氧氟沙星药片，标示含量100 mg/片)，经超声助溶和羟丙基羟丙基-环糊精环糊精No.1 doi:10.3866/PKU.DXHX202202025 1890.45 m滤膜过滤后制成样品溶液。对于滴眼液样品(标示含量2.40 mg/支，0.8 mL)，可直接用超纯水稀释。进样时，用50 molL1 HAc+5 mmolL1 HP-CD溶液稀释到合适浓度，上机测定。1.3 实验步骤和相关参数实验步骤和相关参数石英毛细管在使用前的处理及其他实验条件参照文献方法8。实验中，每2次进样之间仅需用运行液冲洗3 min，基线运行6 min。CE仪器参数：分离电压：+15 kV，电动进样：+11 kV 8 s；石英毛细管：45 cm 50 m i.d.，Leff=40 cm；C4D检测器的信号经数据工作站采集到计算机中，进行电泳谱图显示、数据存储和定量分析处理。2 结果与讨论结果与讨论2.1 样品分析及结果样品分析及结果在选定的实验条件下，按1.2节方法处理实际样品和进样分析。通过标准加入法确定CE-C4D谱图中氧氟沙星对映体(S-ofloxacin，R-ofloxacin)所对应的电泳峰。结果表明，S-ofloxacin峰在前，R-ofloxacin峰在后，参见氧氟沙星对映体的CE-C4D谱图。以取代度7.9的羟丙基-环糊精为手性选择剂，对某厂家氧氟沙星药片和氧氟沙星滴眼液的测定结果分别为101 mg/片和2.45 mg/支，与产品标示值100 mg/片和2.40 mg/支相符。2.2 羟丙基羟丙基环糊精取代度对分离度的影响环糊精取代度对分离度的影响羟丙基-环糊精是由-环糊精经衍生化获得，文献方法一般采用-环糊精和环氧丙烷在氢氧化钠的作用下通过取代反应合成1012，见图2。图图2 羟丙基羟丙基-环糊精的合成环糊精的合成-环糊精由7个葡萄糖单元组成，而每个葡萄糖单元中2位和6位上的羟基易反应，因此-环糊精骨架上有14个易发生取代反应的活性位点10,12。这些活性位点在与环氧丙烷的反应中由于受到反应温度、时间和原料比的影响，将会产生多种取代度的产物，其中原料配比是决定羟丙基-环糊精取代度的重要因素12。在实际工作中，用平均取代度DS(degree of substitution)来代表环糊精骨架上羟基被取代的数量。文献13指出不同取代度的羟丙基-环糊精与客体药物分子之间的包合物表观平衡常数存在显著的差异。为此，本实验中采用4种不同取代度(DS=4.1，6.2，7.9，9.1)的羟丙基-环糊精，考察其对氧氟沙星对映体分离度的影响。不同取代度羟丙基-环糊精的氧氟沙星对映体分离度测定结果见表1，其CE-C4D谱图如图3所示。由表1和图3可知，不同取代度的羟丙基-环糊精对氧氟沙星对映体的分离度存在显著差异，当DS=7.9时分离度最大。文献10,13指出环糊精与客体分子之间的包合过程是氢键、范德华力和疏水作用力三者协同作用的结果。不同取代度的羟丙基-环糊精由于羟丙基数目的不同，造成了与客体分子氧氟沙星2个对映体分子之间包合物平衡常数的差异，而这种差异在DS=7.9时达到最大。反映在CE分离上，取代度7.9的羟丙基-环糊精作为手性选择剂时，可获得最佳的对映体分离度。应当指出，对于不同分子结构的手性药物，由于其与羟丙基-环糊精的包合作用力也不同,因此适合不同手性药物对映体分离的DS值也将不同。190 大 学 化 学 Vol.38表表1 不同取代度羟丙基不同取代度羟丙基-环糊精的氧氟沙星对映体分离度测定结果环糊精的氧氟沙星对映体分离度测定结果(n=5)取代度(DS)4.1 6.2 7.9 9.1 分离度 0.75(4.14%)0.88(4.09%)1.98(3.90%)1.42(3.97%)括号中数据为相对标准偏差(RSD)图图3 不同取代度羟丙基不同取代度羟丙基-环糊精分离氧氟沙星对映体的环糊精分离氧氟沙星对映体的CE-C4D谱图谱图 DS：取代度；S：S-ofloxacin；R：R-ofloxacin 2.3 市售羟丙基市售羟丙基-环糊精的质量评估环糊