升麻素衍生物的合成及抗炎构效关系研究_戴炜辰.pdf

2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 13 升麻素衍生物的合成及抗炎构效关系研究升麻素衍生物的合成及抗炎构效关系研究 戴炜辰，陈璟*(南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300)摘 要通过简便有效的提取分离流程，从防风中得到量丰的升麻素；在其结构基础上对各官能团进行结构修饰，合成了总计 10个衍生物，结构经核磁共振氢谱、碳谱分析确证。采用 Griess 法测定相关化合物对 RAW264.7 细胞的体外抗炎活性。总结出升麻素的抗炎构效关系：苯并-吡喃酮母核、2 位羟甲基、5 位酚醚以及 4位羟基等结构均是其抗炎活性必须基团；其中 2 位羟基烃化成醚，4位羟基酰化成酯后活性提高。关键词防风；升麻素；结构修饰；抗炎；构效关系 中图分类号R914.4 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)04-0013-04 Synthesis and Anti-inflammatory Structure-activity Relationship of Cimifugin Derivatives Dai Weichen,Chen Jing*(Nanjing University of Chinese Medicine Hanlin College,Taizhou 225300,China)Abstract:Through a simple and effective extraction and separation process,a large amount of cimifugin was obtained from Saposhnikoviae Radix;On the basis of its structure,10 derivatives were synthesized by modifying the functional groups.The structures were confirmed by H-NMR and C-NMR analysis.The anti-inflammatory activity of related compounds on RAW264.7 cells was determined by Griess method.Structure-activity relationship of cimifugin was summarized:benzo-pyrone core,2-hydroxymethyl,5-phenol ether and 4-hydroxyl groups are necessary groups for its anti-inflammatory activity;and the activity was improved after alkylation of 2-hydroxyl group or acylation of 4-hydroxyl group.Keywords:Saposhnikoviae Radix；cimifugin；structural modification；anti-inflammatory；structure-activity relationship 升麻素(cimifugin)是传统中药防风(Saposhnikoviae Radix)的主要活性成分，具有广泛的药理作用，包括解热镇痛1，抗炎2-3，抗氧化4，抗过敏5，抗肿瘤6,7和抗银屑病8等。其中，升麻素对 LPS 诱导的巨噬细胞炎症模型作用机制比较明确，即通过抑制 MAPK/NF-B 信号通路的激活，下调 iNOS 和COX-2 的表达，从而抑制细胞 NO 等炎症因子的释放，发挥抗炎作用4,9。升麻素具有二氢呋喃色原酮结构(图 1)，在药材中主要以升麻苷的形式存在。作为中药防风的质量控制成分之一，药典规定升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量不少于0.24%10。升麻苷在体内脱糖生成升麻素4，以苷元的形式吸收成为防风色原酮的主要入血成分11-12。目前，升麻素结构母核上各官能团对其活性的影响以及整体的构效关系研究尚未见报道。相关研究的缺乏限制了进一步的机制研究与基于中药防风的创新药物开发。因此，本文以升麻素为研究对象，通过对其进行结构修饰合成衍生物，并以LPS 刺激的 RAW264.7 为炎症细胞模型，采用 Griess 法测定升麻素及相关衍生物对 NO 释放的抑制作用，在此基础上总结升麻素的抗炎构效关系，为进一步的结构优化提供研究基础。图图 1 防风中二氢呋喃色原酮类化合物防风中二氢呋喃色原酮类化合物 Fig.1 Dihydrofuran chromones of S.divaricate 1 仪器与试剂仪器与试剂 Brucker AV500核磁共振仪(德国BRUKER公司)；Agilent 1290-6120单四极杆质谱(美国安捷伦科技公司)；BP211D电子分析天平(德国Sarorius公司)。防风(购于安徽亳州)，升麻苷(南京良纬生物科技有限公司，批号：lw16052601)；5-O-甲基维斯阿米醇苷(源叶生物，批号：Y24J11H119521)。所用试剂均为分析纯，无水溶剂按照相应标准进行处理。RAW264.7细胞(ATCC细胞库)；高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(德国Capricorn Scientific公司)；LPS(美国Sigma公司)；一氧化氮检测试剂盒(碧云天)2 升麻素的提取升麻素的提取 图图 2 升麻素和升麻素和 5-O-甲基维斯阿米醇的提取甲基维斯阿米醇的提取 Fig.2 Extraction of cimifugin and 5-O-methylvisamminol 收稿日期 2022-08-07 基金项目 江苏省高校自然基金(NO.22KJB360014，18KJD360001)；江苏省中医药科技发展计划项目(YB2020108)；江苏省青蓝工程骨干教师 项目 作者简介 戴炜辰(1988-)，男，江苏泰州人，讲师，主要研究方向为天然产物结构修饰与活性研究。*为通讯作者：陈璟(1987-)，男，江苏泰州人，副教授，主要研究方向为中药药理。广 东 化 工 2023 年 第 4 期 14 第 50 卷 总第 486 期 防风色原酮成分在药材中主要以苷的形式存在，因此干燥的防风药材以乙醇回流提取后，减压浓缩提取液，分别以石油醚、乙酸乙酯洗去脂溶性物质，剩余水层直接加酸升温水解，乙酸乙酯萃取后，经硅胶柱层析分离，以 1.1 和 0.55 的收率直接得到升麻素 1 以及 5-O-甲基维斯阿米醇 2(图 2)。3 升麻素衍生物的合成升麻素衍生物的合成 图图 3 升麻素衍生物的合成升麻素衍生物的合成 Fig.3 Synthesis of cimifugin derivatives 由于防风中主要色原酮升麻素和 5-O-甲基维斯阿米醇的区别在 2 位的伯羟基，因此重点对该位点进行考察。以升麻素为原料，对 2 位羟基进行修饰分别得到烃化产物 3 和酰化产物4。通过 Jones 试剂氧化，生成 2 位羧基取代的产物 5，进一步酯化得到升麻素 2-羧酸乙酯 6(图 3a)。升麻素在 BBr3中脱去甲基，得到 5-去甲升麻素 7(图 3b)，通过与 4 位羰基形成分子内氢键，考察相关官能团对活性的影响。在此基础上，进一步合成了 5 位烯丙基和苄基取代产物(8 和 9)。升麻素 4位羟基的修饰需对 2 位伯醇进行保护，因此直接以 2 位烯丙基醚 3为原料，乙酸酐作为酰化剂，对甲苯磺酸催化下，形成酰化产物 10。10 溶于四氢呋喃，在 DMBA(1,3-二甲基巴比妥酸)和Pd(PPh3)4催化下，选择性的脱去烯丙醚保护基，生成 4乙酰化产物 11。3 在 Burgess 试剂作用下，顺利脱水得到 12。12在 DMBA 和 Pd(PPh3)4催化下，得到 13(图 3c)。升麻素通过催化氢化还原得到 2，3-二氢升麻素 14(图 3d)，以考察升麻素中C2/C3 双键对其活性的影响。4 抗炎构效关系抗炎构效关系 采用 LPS 刺激 RAW264.7 细胞，考察升麻素及其衍生物对 NO 释放的抑制作用，结果如表 1。除升麻素 1、化合物 3、8、9、11 和升麻苷外，其余化合物均没有显著的抑制作用。表表 1 升麻素及其衍生物的抗炎活性升麻素及其衍生物的抗炎活性 Tab.1 Anti-inflammatory activity of cimifugin and its derivatives 化合物 抑制率a/%IC50/M 化合物 抑制率a/%IC50/M 1 57.2 50.05.5 8 59.5 45.43.7 2 11.6-9 70.4 28.81.9 3 64.6 38.72.9 11 69.7 12.32.2 4 16.8-13 7.5-5 7.2-14 17.0-6 11.6-升麻苷 93.7 5.32.6 7 14.8-5-O-甲基维斯阿米醇苷 18.4-a NO Inhibition in 100 M 升麻素1具有中等的抗炎活性，而5-O-甲基维斯阿米醇2、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素-2-羧酸 5、升麻素-2-羧酸乙酯6 以及酰化产物 4 等均没有明显的抗炎活性，说明升麻素 2 位羟甲基是活性必须基团，氧化或酰化后活性均降低。2 位羟基经烃化成醚后，化合物 3 活性提高，而形成糖苷后，升麻苷的活性最高。5 位脱甲基产物 7 没有明显活性，而烯丙基和苄基取代产物 8，9 活性均有提高。说明 5 位羟基氢与 4 位羰基分子内氢键的形成不利于其抗炎活性；5 位形成酚醚结构是活性必须的。4位脱羟基产物 13 没有明显活性，说明升麻素 4位的氧是活性必须的；酰化后产物 11 活性显著提高。2，3-二氢2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 15 升麻素 14 也没有明显活性，说明苯并-吡喃酮母核也是活性所必须的。综上，升麻素结构中苯并-吡喃酮母核是抗炎活性必须基团；2 位羟基氧化、酰化后活性均降低，成醚后活性提高，其中天然升麻苷(升麻素 2 位羟基的糖苷化产物)活性最高；5位酚醚结构是活性必须基团；4位羟基也是活性必须的，酰化成酯后活性有显著提高。5 实验操作实验操作 2-O-烯丙基升麻素3的合成：升麻素 1(62 mg，0.2 mmol)溶于 2 mL 丙酮中，加入碳酸钾(138 mg，1 mmol)。室温搅拌 15 min，滴加烯丙基溴(35 L，0.4 mmol)，升温回流反应 12 h，减压浓缩，缓慢加入 10 mL水，乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇=601)，得淡黄色油状物 3(46 mg，0.133 mmol，67%)。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)：6.51(s，1H)，6.22(s，1H)，5.96-5.88(m，1H)，5.33(dd，J=17.3 Hz，1.7 Hz，1H)，5.25(dd，J=10.5 Hz，1.5 Hz，1H)，4.72(t，J=8.7 Hz，1H)，4.32(s，2H)，4.10(d，J=5.7 Hz，2H)，3.93(s，3H)，3.26(d，J=8.5 Hz，2H)，1.34(s，3H)，1.24(s，3H);13C-NMR(125 MHz，CDCl3)：177.0，164.5，162.3，159.6，155.9，133.6，118.2，117.3，112.3，110.7，93.9，91.3，72.1，71.6，67.7，61.0，27.8，25.8，24.3；ESI-MS(m/z)：M+H+=347.1。2-O-乙酰基升麻素 4 的合成：升麻素 1(61 mg，0.2 mmol)溶于 0.4 mL Ac2O 中，加入 0.4 mL 吡啶。室温搅拌 1 h，缓慢加入 1 M 盐酸 50 mL，乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯=11)，得淡黄色