视蛋白3调控人真皮成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白生成_牟慧玲.pdf

基金项目国家自然科学基金面上项目(81972920);贵州省自然科学基金(黔科合基础-ZK 2022 一般449，黔科合基础-ZK 2022 一般413)作者单位 1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025;2.贵州医科大学附属医院皮肤科，贵州 贵阳 550004通信作者陆洪光，E-mail:hongguanglu 网络首发时间 2022-12-0512 22 网络首发地址https:/ 年 3 月第 37 卷第 3 期Mar.2023，Vol37，No3265http:/视蛋白 3 调控人真皮成纤维细胞型胶原蛋白生成牟慧玲1，2，曾雯2，董仙2，汪宇2，张伟2，冯江龙2，兰应华2，罗欢欢2，叶藤2，陆洪光2 摘要 目的研究视蛋白3 在正常人真皮成纤维细胞中对型胶原蛋白生成的影响及其可能的机制。方法取小儿包皮真皮成纤维细胞分离、培养、传代，至 3 5 代，用荧光定量 PC、蛋白免疫印迹分别检测视蛋白 1 5 的表达，细胞免疫荧光检测视蛋白 3 及型胶原蛋白表达及定位。设计针对人视蛋白 3 的小干扰 NA，利用脂质体转染入正常人真皮成纤维细胞，分别用荧光定量 PC、蛋白免疫印迹检验视蛋白 3 抑制效率。成功下调视蛋白 3 后，用荧光定量 PC、免疫印迹法、酶联免疫吸附测定及细胞免疫荧光检测型胶原蛋白表达变化;通过 CCK-8 及 EDU 检测细胞增殖活力，流式细胞仪检测细胞周期，Transwell 检测细胞迁移能力;通过蛋白免疫印迹法检测 PI3K、AKT 及磷酸化蛋白 p-PI3K、p-AKT 的表达情况。最后抑制通道蛋白 AKT 的磷酸化，通过蛋白免疫印迹法检测型胶原蛋白表达变化。结果视蛋白 1 5 均在正常人真皮成纤维细胞中表达，其中视蛋白 3 基因及蛋白表达水平较其他视蛋白表达高，差异有统计学意义(P 0.05)。下调正常人真皮成纤维细胞中视蛋白 3 后，细胞合成及分泌型胶原蛋白水平降低，差异有统计学意义(P 0.05);细胞增殖、迁移能力减弱，差异有统计学意义(P 0.05);细胞周期中 S 期比例明显降低，差异有统计学意义(P 0.05);磷酸化蛋白 p-PI3K、p-AKT 的蛋白表达水平被明显抑制;抑制通路蛋白 AKT 的活化后，细胞合成型胶原蛋白水平降低。结论视蛋白 3 参与调控正常人真皮成纤维细胞中型胶原蛋白的合成，可能是创伤愈合、纤维化相关疾病及医疗美容潜在的治疗靶点。关键词 视蛋白 3;成纤维细胞;型胶原蛋白 中图分类号 751;622 文献标志码 A 文章编号 1001 7089(2023)03 0265 08 DOI 10 13735/j cjdv1001-7089 202206150Opsin 3 egulating Type Collagen Synthesis in Human Dermal FibroblastsMOU Huiling1，2，ZENG Wen2，DONG Xian2，WANG Yu2，ZHANG Wei2，FENG Jianglong2，LANYinghua2，LUO Huanhuan2，YE Teng2，LU Hongguang2(1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China;2.Department of Dermatology，the AffiliatedHospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China)Corresponding author LU Hongguang，E-mail:hongguanglu Abstract ObjectiveTo explore the effect of opsin 3 on type collagen synthesis in normalhuman dermal fibroblasts and its possible mechanism MethodsNormal humandermal fibroblasts(NHDFs)in children were isolated，cultured and passaged to 3-5passages.The expression levels of opsin 1-5 were detected by T-qPC and Westernblot，and the expression and localization of opsin 3 and type collagen werehttp:/detected by cell immunofluorescence.A small interfering NA targeting human opsin3 was designed and transfected into NHDFs by liposomes.The inhibition efficiency ofopsin 3 was detected by T-qPC and Western blot.After opsin 3 was silencedsuccessfully，the expression level of type collagen was detected by T-qPC，Westernblot，enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)andcellularimmunofluorescence，respectively.Cell proliferation activity was detected by CCK-8and EDU，cell cycle was detected by flow cytometry，and cell migration ability wasdetected by Transwell.The expression levels of PI3K，AKT and phosphorylatedproteins were detected by Western blot.After the phosphorylation of channel proteinAKT was inhibited，the protein level of type collagen was detected by Westernblot esultsAll opsins(1-5)were all expressed in NHDFs，and the gene andprotein expression level of opsin 3 was higher than that of other opsins(P 0.05).After down-regulation of opsin 3 in NHDFs，the levels of cell synthesis and secretionof type collagen were decreased(P 0.05);the ability of cell proliferation andmigration was weakened(P 0.05);the proportion of S phase in the cell cycle wassignificantly decreased(P 0.05);the expression levels of phosphorylated proteinsp-PI3K and p-AKT were significantly inhibited.After inhibiting the activation of AKT，the protein level of collagenwas decreased ConclusionOpsin 3 is involved in theregulation of typecollagen synthesis in NHDFs，and may be a potential therapeutictarget for wound healing，fibrosis-related diseases and medical cosmetology.Key words Opsin3;Fibroblast;Collagen 胶原蛋白(collagen)是细胞外基质的主要框架结构1。人类皮肤胶原蛋白主要由、型胶原蛋白构成，成纤维细胞是合成胶原蛋白的主要细胞。型胶原蛋白(collagen，COL-1)是最常见的胶原蛋白，占正常人皮肤胶原蛋白的 70%以上2-3。胶原蛋白在皮肤正常生理过程及疾病的发生中有着重要的作用，如伤口愈合、皮肤老化及增生性瘢痕形成等4-5。近年来，促进成纤维细胞胶原蛋白合成达到医疗美容目的及抑制胶原蛋白合成治疗瘢痕疙瘩成为研究热点6。视蛋白(opsins，OPNs)属于光敏 G 蛋白偶联受体(G protein-couped receptors，GPCs)超家族，通过 GPC 信号通路介导光转导7-9。视蛋白 3(opsin3，OPN3)是视蛋白家族中的一员，最近的研究10 表明，视蛋白存在于包括皮肤在内的眼外组织中。它们不仅在眼内有光传导功能，其在眼外也有非光依赖功能。视蛋白 3 被发现可参与肝癌细胞的凋亡，在肺腺癌中促进上皮间质转化和肿瘤转移，在皮肤微血管内皮细胞中可以调节血管生成11;视蛋白 3 在皮肤中被发现可调控黑素细胞的凋亡和色素形成12-13，可调控角质形成细胞的分化14。视蛋白 3 在皮肤的多种功能被逐步揭示，本课题组进一步关注视蛋白 3 是否能调控人真皮成纤维细胞合成胶原蛋白，本文拟对视蛋白 3在人真皮成纤维细胞中对型胶原蛋白合成的影响及其可能的机制进行研究。1材料与方法1.1细胞和主要试剂来源正常人真皮成纤维细胞来自贵州医科大学附属医院小儿外科包皮切除手术患儿的废弃包皮，实验获得患者同意并经过伦理审查;DMEM 细胞培养基购自美国 Gibco 公司;T-PC 试剂盒购自美国 Thermo Fisher 公司;ELISA 试剂盒购自美国 D Systems 公司;一抗、二抗购自中国 Affinity 公司、美国 Santa Cruz 公司及英国 Ab-cam 公 司;Lipo-fectamine 2000 购 自 美 国 ThermoFisher 公司;CCK-8 试剂盒购自日本 Dojindo 公司;EDU 细胞增殖检验试剂盒购自南京碧云天生物技术有限公司;Transwell 小室购自美国 Corning 公司;细胞周期与凋亡试剂盒购自上海七海复泰生物科技有限公司;AKT 抑制剂(MK-2206 2HCI)购自美国Selleck Chemicals 公司。引物由上海捷瑞生物公司合成，本研究中使用了以下人类引物:GAPDH F，5-GACATCCGCAAAGACCTG-3;GAPDH，5-GGAAG-GTGGACAGCGAG-3;OPN3 F，5-CAATCCAGTGATT-TATGTCTTCATGATCAGAAAG-3;OPN3，5-GCATT-662中国皮肤性病学杂志 2023 年 3 月第 37 卷第 3 期Chin J Derm Venereol，Mar.2023，Vol.37，No.3牟慧玲，曾雯，董仙，等 视蛋白 3 调控人真皮成纤维细胞型胶原蛋白生成http:/TCACTTCCAGCTGCTGGTAGGT-3;COL1A1 F，5-TGAGCCAGCAGATCGAGA-3;COL1A1，5-ACCA-GTCTCCATGTTGCAGA-3。1.2细胞分离及培养正常人真皮成纤维细胞(NHDFs)是利用 4 12 岁小儿包皮手术后废弃包皮，消毒、清洗、去除皮下组织后剪成约 1 cm 1 cm皮片，使用 0.25%Dispase 酶将组织块 4 过夜消化，眼科镊分离真表皮，将真皮贴于培养皿中，37，5%CO2培养