圣草次苷通过上皮间充质转化...抑制肺腺癌细胞的增殖及迁移_高明朗.pdf

海南医学院学报 2023，29（3）Journal of Hainan Medical University圣草次苷通过上皮间充质转化途径抑制肺腺癌细胞的增殖及迁移高明朗，赖凯，邓宇，卢子龙，徐宸桢，王文捷，李宁，耿庆（武汉大学人民医院胸外科，湖北 武汉 430060）摘 要 目 的：探 究 圣 草 次 苷（Eriocitrin）对 肺 腺 癌（Lung adenocarcinoma，LUAD）细 胞 系 A549 和 H1299 增殖和迁移能力的影响，以及对上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的作用机制。方法：采用 CCK8 方法检测不同浓度圣草次苷对 LUAD细胞系 A549和 H1299增殖能力的影响；采用划痕实验评价 A549和 H1299细胞的迁移能力；用 Western Blot法和 qRT-PCR法分别检测 EMT相关上皮钙黏蛋白（E-cadherin和 N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、铁死亡相关蛋白 SLC7A11、GPX4、FTH 和 EMT 标志分子 E-cadherin、N-cadherin、Snail的 mRNA 水平，及细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，观察圣草次苷对 LUAD 细胞系铁死亡的影响。结果：圣草次苷可以明显抑制 LUAD 细胞系 A549和 H1299的增殖能力，并呈现出一定的剂量和时间依赖性。与对照组相比，不同浓度的圣草次苷作用 24和 48 h后均明显降低划痕愈合率，差异具有统计学意义（P0.01）。与对照组相比，圣草次苷增加了 LUAD 细胞系 A549和 H1299 的 ROS 的表达水平，增加了 EMT 相关蛋白 E-cadherin 的蛋白表达水平，降低了 N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达水平。此外，qRT-PCR 结果也显示：圣草次苷上调了 E-cadherin mRNA 的表达，下调了N-cadherin、Snail mRNA 表达，铁死亡相关基因 SLC7A11、GPX4、FTH 蛋白水平均下调，差异具有统计学意义（P0.05）。结论：圣草次苷通过 EMT 途径抑制 LUAD 细胞的增殖和迁移，并促进铁死亡过程的发生，在 LUAD预防和辅助化疗中具有一定的应用潜力。关键词 圣草次苷；肺腺癌；增殖；迁移；上皮间充质转化；铁死亡中图分类号 R734.2 文献标识码 A 文章编号 1007-1237（2023）03-0190-08Eriocitrin inhibits proliferation and migration of lung adenocarcinoma cells by regulating epithelial mesenchymal transitionGAO Ming-lang，LAI Kai，DENG Yu，LU Zi-long，XU Chen-zhen，WANG Wen-jie，LI Ning，GENG Qing（Department of Thoracic Surgery，Peoples Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China）Foundation Project：This study was supported by Basic Research Foundation for Universities of the CPC Central Committee（No.2042021KF0081）；Innovation Group of Natural Science Foundation of Hubei Province（2020CFA027）Author：GAO Ming-lang，E-mail：.Correspondence to：GENG Qing，Chief Physician，Professor，M.D.，E-mail：.Received：2022-10-23 Revised：2022-12-15 JHMU，2023；29（3）：190-197View from specialist:It is creative,and of certain scientific and educational value.ABSTRACT Objective：To investigate the effects of Eriocitrin on the proliferation and migration of Lung adenocarcinoma（LUAD）cells A549 and H1299，and the mechanism of Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT）.Methods：The effects of dif-ferent Eriocitrin on the proliferation of LUAD cells A549 and H1299 were examined by CCK8 method.EMT-associated epithelial calmodulin（E-cadherin and N-cadherin），vimentin，ferroptosis-associated protein SLC7A11，GPX4，FTH were detected by Western Blot and expression of mRNA of EMT marker molecules E-cadherin，N-cadherin，Snail were detected by qRT-PCR.Ef-DOI：10.13210/ki.jhmu.20221219.001网络出版地址：https：/ 中央高校基本科研专项基金（2042021kf0081）；湖北省自然科学基金创新群体（2020CFA027）作者简介 高明朗，E-mail：。通讯作者 耿庆，主任医师，教授，博士，E-mail：。收稿日期 2022-10-23 修回日期 2022-12-15 网络出版时间：2022-12-20 13：35：44190高明朗等.圣草次苷通过上皮间充质转化途径抑制肺腺癌细胞的增殖及迁移fects of saccharomyces cerevisiae suberin on ferroptosis in LUAD cells as observed by lipid reactive oxygen species（ROS）assay.Results：Eriocitrin could significantly inhibit the proliferative behavior of LUAD cells A549 and H1299 and showed a certain dose-and time-dependence.Compared with the control group，different concentrations of Eriocitrin could significantly reduce the scratch healing rate after 24 and 48 h of action，and the difference was statistically significant（P0.01）.The expression of ROS is in-creased，EMT-related protein E-cadherin was increased in LUAD cells A549 and H1299 compared with the control group after the intervention with Eriocitrin.N-cadherin and Vimentin expression was decreased.E-cadherin mRNA expression was increased，and N-cadherin，Snail mRNA expression was decreased，expression of ferroptosis-associated protein SLC7A11，GPX4，FTH was decreased，the difference was statistically significant（P90%时利用 200 L移液枪头在培养箱板底垂直划线，用 PBS缓冲液洗净未贴壁细胞后，分别加入含不同浓度圣草次苷（20、40、80 mol/mL）的无血清培养基，同时设置对照组不含圣草次苷的无血清培养基；继续培养 0、24、48 h后显微镜观察拍照，每组每个时间点随机选 4 个视野，取平均值作为每组每个时间点的最终结果，实验重复 3次。Image J软件对图片进行分析处理。1.7Western Blot法检测检测 LUAD 细胞系 A549、H1299 EMT相关蛋白的表达水平A549、H1299 细 胞 系 常 规 培 养 后，给 予 40 mol/mL 的圣草次苷作用 48 h；采用 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度并调整到相同浓度后，加热变性。每组取 10 L 样品进行电泳，转膜、封闭后，与 4 冰箱过夜孵育一抗E-cadherin（货号：20874-1-AP）、N-cadherin（货号：22018-1-AP）、Vimentin（货号：10366-1-AP）、GAP-DH（货号：10494-1-AP）浓度均为 1 2 000；次日洗膜后孵育二抗（G1213-100UL）比例为 1 5 000，2 h后洗膜，ECL 化学发光成像系统显影，以 GAPDH为内参，采用 Image J软件对蛋白条带进行半定量分析。实验重复 3次。1.8qRT-PCR 法检测检测 LUAD 细胞系 A549、H1299 EMT相关基因 mRNA的表达A549、H1299 细胞常规培养后，给予 40 mol/mL 的圣草次苷作用 48 h；用 RNA 提取液提取细胞总 RNA，用逆转录试剂盒合成 cDNA 后进行 PCR扩增并定量测量浓度（引物序列见表 1）。实验均重复 3次。1.9A549和 H1299细胞 ROS水平测定DHE在DMSO中溶解至最终浓度为5 mmol/L，然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS，1 1 000）中进一步稀释至 DMSO 的最终浓度为 0.1%。A549、H1299 细胞系常规培养后，给予 40 mol/mL 的圣草次苷干预 48 h；将 A549 和 H1299 细胞接种于 6 孔板中，用DCFH-DA 工作液（10 mol/L）在 37 下孵育 30 min，最后用荧光显微镜观察 ROS 水平，Image J 软件对图片进行分析处理。1.10 Western Blot 法 检 测 检 测 LUAD 细 胞 系A549、H1299铁死亡相关蛋白的表达水平A549、H1299 细 胞 系 常 规 培 养 后，给 予 40 mol/mL 的圣草次苷干预 48 h；采用 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度并调整到相同浓度后，加热变性。每组取 10 L 样品进行电泳，转膜、封闭后，与 4 冰箱过夜孵育一抗SLC7A11（26864-1-AP）、GPX4（货号：67763-1-Ig）、FTH（68068-1-Ig）抗体稀释比例均为 1 2 000；次日洗膜后孵育二抗（G1213-100UL）抗体稀释比例均为 1 5 000，2 h 后洗膜，ECL 化学发光成像系统显影。实验重复 3次。1.11统计学处理数 据 表 示 为 平 均 值 标 准 差（x s），并 用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）分析。两样本之