生育力保存中玻璃化冷冻载杆的研究趋势及监管挑战_张坤智.pdf

医疗卫生装备2023年1月第44卷第1期Chinese Medical Equipment JournalVol 44No 1January2023生育力保存中玻璃化冷冻载杆的研究趋势及监管挑战张坤智，晁园，孙晓晴，俞卉，王越*，齐伟明*（浙江省医疗器械审评中心审评二科，杭州 310009）摘要阐述了生育力保存过程中关键医疗器械玻璃化冷冻载杆的演化历程，分析了现有的“开放式冷冻、开放式保存”“开放式冷冻、封闭式保存”及“封闭式冷冻、封闭式保存”3 种玻璃化冷冻载杆的优势与弊端，提出了玻璃化冷冻载杆的改良趋势并提供了研究思路，立足监管挑战剖析了玻璃化冷冻载杆监管关注点，为提升生育力保存的有效利用率及国产辅助生殖医疗器械的发展提供了助力。关键词生育力保存；玻璃化冷冻；玻璃化冷冻载杆；辅助生殖；卵母细胞保存中国图书资料分类号R318.6；TH789文献标志码A文章编号1003-8868（2023）01-0081-06DOI：10.19745/j.1003-8868.2023014Research tendency and regulatory challenge of vitrificationcryopreservation straws in fertility preservationZHANG Kun-zhi,CHAO Yuan,SUN Xiao-qing,YU Hui,WANG Yue*,QI Wei-ming*(No.2 Department of Evaluation,Zhejiang Medical Device Evaluation Center,Hangzhou 310009,China)AbstractThe development of vitrification cryopreservation straws in fertility preservation was elaborated.Three kinds ofvitrification cryopreservation straws of open freezing with open preservation,open freezing with closed preservation andclosed freezing with closed preservation were analyzed on their advantages and disadvantages.The improvement trends andresearch ideas were proposed for vitrification cryopreservation straws.The issues for supervising vitrification cryopreservationstraws were explored in light of the regulatory challenges.The effective utilization of fertility preservation and assisted repro-ductive devices in China were promoted greatly.Chinese Medical Equipment Journal，2023，44（1）：81-86Key wordspreservation of fertility;vitrification freezing;vitrification cryopreservation straw;assisted reproduction;oocytepreservation0引言生育力保存通常具体地指向女性的卵巢功能特别是卵母细胞质与量的保护及保存，而女性的卵母细胞对于生育而言属于“稀缺资源”，是人类生育力的瓶颈限制环节1。根据国内外生育力保存指南的建议，卵母细胞冷冻保存和胚胎冷冻保存一样，都是生育力保存的一线治疗方案。与程序冷冻法相比，玻璃化冷冻法使卵母细胞在冷冻保护剂的作用下迅速降温，将细胞内外液直接转变为非晶体的玻璃化状态，从而避免胞内形成冰晶对细胞造成机械损伤，在我国已成为卵母细胞冷冻保存的主流方法。生育力保存服务于人类体外辅助生殖技术（arti-ficial reproductive technique，ART），ART 作为人类生殖健康产业的重要组成，其相关的医疗器械产业在全球范围内迅速发展。ART 涉及的医疗器械品类众多，包括取卵针等手术器械，胚胎移植导管、玻璃化冷冻载杆、培养皿等耗材类医疗产品，以及与配子、合子、胚胎接触的培养液等。在这些医疗器械中，玻璃化冷冻载杆是卵母细胞的承载者且装载卵母细胞后可在液氮中长期保存2，但冷冻保存过程中微小的不确定因素都会对卵母细胞乃至未来的个体发育带来无法控制的影响，故而玻璃化冷冻载杆被视为生育力保存过程中的关键医疗器械。本研究立足玻璃化冷冻载杆的发展现状及呈现出的优势、弊端，瞻望玻璃化冷冻载杆的研究改良趋势，进而应对随之而基金项目：浙江省药品监管系统科技计划项目（2021049）作者简介：张坤智（1987），女，博士，工程师，主要从事无源医疗器械审评方面的研究工作。通信作者：王越，E-mail：；齐伟明，E-mail： 学术论坛 张坤智，晁园，孙晓晴，等.生育力保存中玻璃化冷冻载杆的研究趋势及监管挑战J.医疗卫生装备，2023，44（1）：81-86.Thesis论著Thesis论著 81 医疗卫生装备2023年1月第44卷第1期Chinese Medical Equipment JournalVol 44No 1January2023来的监管挑战并完善风险把控，以期为生育力保存的精深发展提供助力。1玻璃化冷冻载杆的演化玻璃化冷冻载杆的演化经历了“开放式冷冻、开放式保存”“开放式冷冻、封闭式保存”“封闭式冷冻、封闭式保存”3 种模式。20 世纪 90 年代，日本加藤公司研发出完全开放式冷冻载杆 Cryotop（如图 1 所示）3，其由高分子材料注塑而成，卵母细胞放置在载体上，载体前缘加装金属头配重，防止载杆冷冻时漂浮在液氮上。完全开放式的冷冻载杆具有超快的冷冻速率（23 000100 000/min），但伴随着“完全开放”带来超快速冷冻速率的同时也不可避免地造成液氮污染的风险4；同时，卵母细胞长期在液氮中开放式储存可能会造成生物样本丢失。随后，一种“先开放冷冻、再封闭储存”的冷冻载杆 McGill CryoleafTM由丹麦澳励晶公司研发上市，如图 2 所示5。开放的卵母细胞载杆上加装保护套，保护套与载杆间用“锁扣”结构相连，卵母细胞冻存步骤如下：（1）先“解锁”保护套与载杆，将保护套预先浸入液氮中；（2）将卵母细胞装载于冷冻载杆上；（3）将装载卵母细胞的载杆浸入液氮中，在液氮环境下快速将预先浸于其中的保护套与载杆杆体“锁和”；（4）将“锁和”一体的载杆杆体与保护套放置于液氮罐中长期保存。“开放式冷冻”使得 McGillCryoleafTM具备超高冷冻速率，“封闭储存”使得生物样本丢失的可能性大大降低，但 McGill CryoleafTM仍无法避免其开放冷冻过程中生殖细胞被液氮污染的风险。2009 年，Yan 等6使用 McGillCryoleafTM对小鼠卵母细胞进行了 3 组玻璃化冷冻贮存试验，与新鲜小鼠卵母细胞相比，卵母细胞的冷冻复活率、受精及胚胎发育率均显著降低。针对液氮污染生殖细胞的风险，欧洲议会于2004 年通过一项指令，要求进行人体生物样本再植入程序时，必须要通过可控的设备、器械和环境以提高组织包括辅助生殖细胞的安全和质量7；美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）也于 2004 年、2007 年相继发布了人体组织和细胞库安全存储的指令，敦促 ART 从业者无论是生殖细胞的冷冻保存还是长期储存都要转移到更安全的条件下，如灭菌的液氮或封闭的设备8-9。为遵循欧盟和FDA 的指令，尽量降低生殖细胞直接接触液氮造成的潜在污染风险，ART 从业者在液氮方面进行了大量的改造：首先是使用 0.1 m 孔径的滤板对液氮过滤除菌10，或在液氮表面放置紫外灯以除去各种已知的微生物，甚至为减少开放式器械在液氮内存储的污染风险而开发出了液氮蒸汽储存系统11。但这些改造均存在缺陷：0.1 m 孔径的滤板显然无法过滤掉病毒，且液氮内样本需要随时取出、放入，控菌的可操作性差；液氮随时气化，导致紫外光照射覆盖性差；液氮蒸汽系统内温度梯度变化大，冷冻速率低，容易使细胞内外液冰晶化，损害生殖细胞样本。针对液氮的改进未能给生殖样本提供“更安全的条件”，这使得美国在生殖细胞冻存及胚胎移植领域禁止使用开放式玻璃化冷冻器械和冷冻系统，同时提醒ART 从业者将关注点转移至封闭式玻璃化器械的开发使用上，杜绝因液氮直接接触带来的有害物污染。2010 年，法国 Cryo Blo System 研发的 HSV（highsecurity vitrification）封闭冷冻系统510（k）K092398应运而生，如图 3 所示12。HSV 封闭冷冻系统由 3 个部分组成：前端为曲面凹槽的卵母细胞装载杆、一端张口一端封口且封口端加装一段金属棒的 HSV套管、辅助转移配件。卵母细胞装载杆和 HSV 套管热封后浸入液氮冷冻，屏蔽了液氮可能造成的污染，但冷却速率降为 2 900/min。基于同样的思路，图1Cryotop冷冻载杆3图2锁扣式的McGill CryoleafTM“开放式冷冻、封闭式储存”冷冻载杆5张坤智，晁园，孙晓晴，等.生育力保存中玻璃化冷冻载杆的研究趋势及监管挑战J.医疗卫生装备，2023，44（1）：81-86.Thesis论著 82 医疗卫生装备2023年1月第44卷第1期Chinese Medical Equipment JournalVol 44No 1January20232012年加藤公司的 Cryotop CL510（k）K112695（如图 4 所示）研发上市13。该冷冻载杆使用热封装技术，把装载了卵母细胞的载杆在浸入液氮保存前先与保护套热封，隔绝卵母细胞与液氮的接触；同时在保护套前端装配金属头以加速冷却、在载杆中段加装金属环以防止解冻时断裂。“封闭式”冷冻和保存在隔绝液氮污染的同时也显著降低了冷冻速率（3 000/min）。从玻璃化冷冻载杆由“开放”到“封闭”的演化进程中可知，“封闭式”的玻璃化冷冻载杆均由“开放式”产品改造而来，即“管”套“杆”，在浸入液氮冷冻前先由使用者封装。但“管”套“杆”型的封闭式载杆普遍存在明显的缺点：（1）相较开放式载杆，冷冻速率明显降低；（2）热封时外套管若不充分熔化或密封不严，会导致难以检测的慢性泄漏；（3）封闭式冷冻载杆均为高分子材料注塑而成的细长型结构，当其处于极端温度变化（液氮冻存温度-196，复苏温度37 ）或操作转移期间有可能导致外壁损坏，引起泄漏甚至爆炸。我国的胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF）从业者从胚胎损伤率、胚胎种植率、胚胎复苏率、流产率、活产率等方面对现有的开放式、半封闭式、封闭式玻璃化冷冻载杆开展研究，肯定了开放式载杆具备较强的冷冻复苏效率，也验证出封闭式载杆在保护胚胎或卵母细胞不受微生物感染和交叉污染上确实能起到重要作用14-16。2玻璃化冷冻载杆的改良趋势从临床使用及医疗器械的注册情况来看，安全性高的封闭式冷冻载杆是 IVF 从业者用于卵母细胞或者胚胎玻璃化冻存的标准载体，但无法解决的冷冻速率慢的问题又切实影响了卵母细胞的玻璃化速度，增大了胞内形成冰晶造成机械损伤的风险17-18。基于已有的封闭式冷冻载杆的优缺点，既满足卵母细胞的快速玻璃化冷冻，又能在液氮环境下不被污染，同时不会因复温或转移操作时液氮急剧气化造成炸裂损坏事件便成了玻璃化冷冻载杆的改良趋势。（1）冷冻储存复苏均需处于密闭的状态。为使胚胎或卵母