石岐鸽mtDNA_Cytb基因遗传多样性分析_贾晓旭.pdf

2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023研究简报研究简报石岐鸽石岐鸽mtDNAmtDNA CytbCytb基因遗传多样性分析基因遗传多样性分析贾晓旭1，陆俊贤1，唐修君1，叶俊文2，樊艳凤1，马尹鹏1，李正晟3，许小飞3，高玉时1*（1.江苏省家禽科学研究所，江苏扬州225125；2.广东省中山市质量技术监督标准与编码所，广东中山528400；3.中山市石岐鸽养殖有限公司白石分公司，广东中山528400）摘要：为探究石岐鸽的遗传多样性和母系起源，研究对60只石岐鸽线粒体DNA（Mitochondrial genome，mtDNA）细胞色素b（Cytochrome b，Cytb）基因进行PCR扩增和测序，并结合GenBank中鸽Cytb基因序列进行系统发育分析。结果显示：石岐鸽mtDNA Cytb基因序列全长为1 143 bp，碱基T、C、A和G的平均比例分别为24.57%、35.79%、27.36%和12.28%；单倍型多样性为0.7820.029，核苷酸多样性为0.001 690.000 04，平均核苷酸差异为1.927；共发现11个变异位点，其中8个为单一变异位点，3个为简约信息位点，基于变异位点定义了8种单倍型；石岐鸽和原鸽分为A和B两个分支，石岐鸽只分布于A分支。研究表明石岐鸽具有较高的线粒体遗传多样性，母系来源单一。关键词：石岐鸽；线粒体DNA；Cytb基因；系统发育关系中图分类号：S836.2文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-117-04收稿日期：2022-02-16；修回日期：2022-04-08基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1200302）；江苏省自然科学基金项目（BK20221412）；江苏现代农业产业技术体系建设专项资金（JATS 2021 399）作者简介：贾晓旭（1982-），男，硕士，副研究员，主要从事家禽表型精准鉴定和遗传评估研究，E-mail：*通讯作者：高玉时（1967-），男，博士，研究员，主要从事家禽质量安全研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.019石岐鸽原产于广东省中山市石岐镇，已有一百多年的历史。民国初年，香山县旅美华侨带回美国王鸽、贺姆鸽和仑替鸽等著名鸽种，与本地鸽杂交，逐步育成国内著名的石岐鸽。石岐鸽以其优质、高产、耐粗饲而闻名，其肉质鲜嫩多汁，肉味鲜美、带有丁香味，深受粤港澳多地消费者的喜爱，养殖区域已经扩展到福建、广西、四川、安徽、新疆、黑龙江等20多个省、自治区1。近年来，随着商业化配套系的快速发展，我国地方品种生产效率低下的劣势越来越明显，很多品种处于濒危或濒临灭绝状态。种业是农业的“生物芯片”，也是家禽产业的重要组成部分，开展种质资源挖掘、保护和评价是解决我国家禽产业种源“卡脖子”问题的技术前提。目前对家禽种质资源进行评价的分子标记很多，应用较多的为全基因组水平的遗传标记2、微卫星标记3和线粒体DNA标记4。鸽线粒体基因组全长约17.3 kb，mtDNA具有进化速率快、基因结构简单、缺少基因重组和母系遗传等特点，被广泛用于研究种群起源进化、遗传多样性和品种鉴定等方面5-8。细胞色素b基因（Cytochrome b，Cytb）具有序列片段短、进化速率中等、不含影响测序的复杂结构、含有高分辨率的系统发育信息等优点。本研究利用PCR扩增和测序的方法，对石岐鸽群体mtDNA Cytb基因序列的多态性进行检测，并结合已发表的鸽Cytb基因序列进行群体遗传学方面的分析，以期了解石岐鸽群体遗传结构和母系来源，为该品种的保护和选育提供科学依据。1材料与方法1.1试验材料从中山市石岐鸽养殖有限公司生产群随机挑选30对石岐鸽，采集翅膀未完全髓化羽毛23根，采用血液DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取基因组DNA。从美国国家生物技-1172023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023术信息中心（NCBI）数据库中下载原鸽（Columbalivia）Cytb 基因序列，序列号分别为 GQ240309、GU908131、KF926376、KJ722068、KP168712、KP258178、KP319029、KP306517、KF907308 和NC013978，系统发育树构建以岩鸽（Columba rupestris）作为外群，序列号为KX902246。1.2试验方法PCR 扩增和测序引物为同一引物对，正向引物：5-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3；反向引物：5-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50 L PCR反应体系：模板 DNA（50100 ng）2 L，2PCRMaster Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）25 L，10 mol/L上、下游引物各1L，灭菌水21 L。PCR反应条件：95 预变性5 min；95 变性30 s，58 退火30 s，72延伸90 s，运行35个循环；72 延伸10 min；12 终止反应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增片段与目的片段一致后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.3统计与分析测序所获序列通过人工校对后，以原鸽Cytb基因（KF926376）作为参考序列，利用Clustal-X软件比对，删除两端非 Cytb 基因的序列9。用DnaSP 5.10.1软件统计核苷酸多样性、单倍型多样性、平均核苷酸差异、变异位点数、简约信息位点数和单倍型数10。系统发育树用MEGA 6.0软件采用邻接法（NJ）法构建11。采用 Network10.2.0软件绘制Median-joining单倍型网络图12。2结果与分析2.1石岐鸽群体Cytb基因序列分析本研究扩增片段长度为1 490 bp，经过拼接和剪辑，60条线粒体Cytb基因序列长度均为1 143 bp，没有发现插入缺失（InDel）。碱基T、C、A和G的平均比例分别为24.57%、35.79%、27.36%和12.28%，A+T的平均含量为51.93%，显著高于G+C的含量48.07%，表现出一定的AT碱基偏好性。60条序列的单核苷酸多态性分析结果见表1。由表1可知，60个个体共发现11个变异位点，占本研究分析位点总数的0.96%（11/1 143），变异区在501 094 bp之间，其中单一变异位点8个（50、344、522、528、582、693、713、1 094），简约信息位点3个（63、282、417）；变异类型均为转换，其中T-C转换7处，A-G转换4处。2.2石岐鸽遗传多样性和单倍型分析石岐鸽群体的核苷酸多样性、单倍型多样性和平均核苷酸差异分别为 0.001 690.000 04、0.7820.029和1.927。基于60条石岐鸽的Cytb基因序列的11个变异位点，总共分出8种单倍型，其中Hap1和Hap2为优势单倍型，分别占比为33.3%（20/60）和 28.3%（17/60），Hap38 个体数分别为8、8、2、2、2和1。8种单倍型网络关系见图1。结果可知，8种单倍型以Hap1为中心呈现出星状发散结构，演化出多个亚型。2.3石岐鸽遗传进化分析基于本研究发现的 8 种单倍型，以岩鸽（KX902246）为外群，构建了石岐鸽与网上下载的其他地区鸽的系统发育树（见图2）。系统发育树分 化 为 2 个 大 的 分 支，Hap18 与 桃 源 野 鸽（GQ240309）、埃及雨燕鸽（KF926376）、天使鸽研究简报研究简报表1石岐鸽mtDNA Cytb基因区的多态位点分布单倍型KF926376Hap1Hap2Hap3Hap4Hap5Hap6Hap7Hap8变异位点00000000001002345556705684122891903247282334ACTAATATCTTCTCCGCC CGGGC CGC CTCTCGC数量2017882221注：KF926376为标准序列，变异位点竖读4个数字组合为该位点位于线粒体Cytb基因的碱基位置，如：0050代表该变异位点为第50个碱基。图1石岐鸽mtDNA Cytb基因8种单倍型的网络关系Hap4Hap3Hap5Hap1Hap6Hap7Hap2Hap8528713632823444176935221 09450-1182023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023（KJ722068）、张家口野鸽（KP319029）、荆门野鸽（KF907308）聚为一支，芜湖野鸽（GU908131，NC013978）、冰鸽（KP306517）、花鸽（KP168712）和王鸽（KP258178）聚为一支。3讨论本试验结果显示石岐鸽Cytb基因序列的碱基 T、C、A 和 G 含量分别为 24.57%、35.79%、27.36%和12.28%，A+T含量高于G+C含量，并且G含量最低，符合鸟类线粒体基因组具有“非G”偏爱特性和L-链碱基组成的特点13。序列变异一般认为是生物适应环境变化的结果，是产生生物多样性的根本来源，线粒体 D-loop 区突变率一般高于mtDNA其他区域，因此被广泛应用于家禽遗传多样性和起源进化的研究14。鸽线粒体D-loop区由于存在复杂的数目可变串联重复序列（Variable number of tandem repeats，VNTR）15，不适于常规的测序研究。本研究发现石岐鸽mtDNACytb基因序列长度为1 143 bp，发现的11处多态位点在501 094 bp之间，具有较高的突变率，可作为鸽遗传多样性和起源进化的研究分子标记。单倍型多样性和核苷酸多样性是评估群体生物多样性的两个重要参数，数值越高，遗传变异越丰富，生物对环境变化的适应性越强16。目前单倍型多样性和核苷酸多样性评价主要以Grant等17提出的标准，单倍型多样性以0.5为高低临界值，核苷酸多样性以0.005为高低临界值，二者的值越大，群体的多样性程度越高。本研究石岐鸽Cytb基因单倍型多样性为0.782，高于临界值0.5；核苷酸多样性为0.001 69，低于临界值0.005，预示石岐鸽品种形成过程中经历过瓶颈效应，然后种群迅速扩张。石岐鸽单倍型Hap1和Hap2为优势单倍型类群，占群体 61.7%（37/60），Hap2Hap8 以Hap1为中心呈星状发散结构，也提示该群体经历过急剧的群体扩张事件。线粒体是位于细胞核外的细胞器，遗传信息是通过雌性个体的卵细胞传递给下一代，同时线粒体DNA变异具有累积效应，来自同一母系的单倍型会聚类在一起，称为世系或单倍型类群18。本研究发现，不同来源的原鸽可以分为两个分支，揭示原鸽可能有2个母系来源，这与陆俊贤等19和付胜勇等20的研究结果一致，60条石岐鸽均来自A世系，具有单一的母系来源。4结论石岐鸽具有较高的遗传多样性，母系来源单一，鸽mtDNA Cytb基因可作为研究鸽种内系统发育、起源进化的分子标记，为后续石岐鸽的保护与开发利用提供参考。参考文献：1 国家畜禽遗传资源委员会.中国畜禽遗传资源志 M.北京：中国农业出版社，2012：199-201.2 WANG M S，THAKUR M，PENG M S，et al.863 genomes reveal the origin and domestication of chicken J.Cell research，2020，30（8）：693-701.3 包文斌，陈国宏，吴信生，等.中国红原鸡和泰国红原鸡遗传多样性分析 J.遗传，2007，29（5）：587-592.4 GAO Y S，JIA X X，TANG X J，et al.The genetic diversity ofchicken breeds from Jiangxi，assessed with BCDO2 and thecomplete mitochondrial DNA D-loop