神阙穴电针对便秘型肠易激综...肠功能障碍及肠道菌群的影响_谢林林.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药胃肠研究神阙穴电针对便秘型肠易激综合征胃肠功能障碍及肠道菌群的影响谢林林，赵玉粒，黄明桂，古远云（西南医科大学附属中医医院 泸州 646000）摘要：目的探讨神阙穴电针对便秘型肠易激综合征（IBS-C）胃肠功能障碍和微生物区系失调的作用，并初步分析机制。方法健康SD大鼠48只，随机分为空白组、模型组、西沙必利组、电针治疗组（n=12只/组）。采用冰水灌胃法建立IBS-C大鼠模型，模型复制成功后，按相应组别处理方法连续干预28 d。测定大鼠粪便粒数、粪便含水量、腹部撤退反射（AWR）评分及炭末推进率，HE染色观察结肠组织病理变化，ELISA检测结肠组织cGMP含量，qRT-PCR检测结肠组织C-fos mRNA表达，16S rDNA基因测序检测肠道菌群变化。结果与空白组相比，模型组粪便颗粒数、粪便重量、粪便含水量、炭末推进率均明显降低，而AWR 评分、cGMP 含量、C-fos mRNA 表达明显升高（P0.01），肠道菌群微生物中，模型组大鼠普氏杆菌（Prevotella）丰度降低；与模型组比较，电针治疗组大鼠粪便颗粒数、粪便重量、粪便含水量、炭末推进率均明显升高，AWR 评分、cGMP 含量、C-fos mRNA 表达明显降低（P0.5 g），分装于无菌冻存管，对粪便样本进行 16S rDNA 基因测序，使用DNA分离试剂盒提取粪便样本DNA，并使用Nanodrop ND-1000分光光度计检测DNA的质量。使用针对 V4 区的引物集进行 16S rDNA 序列的 PCR 扩增，用QAQUICK PCR纯化试剂盒从未掺入的核苷酸和引物中提纯最终的PCR产物，将纯化的样品归一化到相同的 DNA 浓度，并使用 Illumina MiSeq 测序仪PE250进行测序。1.6统计学分析使用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，数据表示为平均值标准差（x s），除肠道微生物区系分析外，所有其他数据多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），当方差齐性时采用 LSD检验，否则采用 Tamhanes 检验，对于所有分析，P0.05 表示差异具有统计学意义。16S rDNA 序列数据利用QIIME分析。2 结果 2.1神阙穴电针对便秘型肠易激综合征大鼠粪便含水量及粪便粒数的影响与空白组比较，模型组大鼠粪便颗粒数、粪便重量、粪便含水量均明显降低（P0.01）；与模型组比较，电针治疗组大鼠粪便颗粒数、粪便重量、粪便含水量均明显升高（P0.01），见图1。2.2神阙穴电针对便秘型肠易激综合征大鼠结直肠扩张的影响与空白组比较，模型组大鼠AWR评分明显升高，炭末推进率明显降低（P0.01）；与模型组比较，西沙必利组、电针治疗组大鼠AWR评分明显降低，炭末推进率明显升高（P0.01），见图2。2.3神阙穴电针对便秘型肠易激综合征大鼠组织病理学的影响空白组大鼠结肠组织结构完整，黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜分层明显，未见明显变性坏死。模型组大鼠结肠组织结构被破坏，黏膜层全层溶解坏死较为明显，黏膜上皮脱落缺失，固有层内肠腺溶解基本消失，坏死区域及肠腔内可见坏死细胞碎片聚集，局部区域固有层轻微出血。西沙必利组大鼠局部结肠组织结构被破坏，黏膜浅表坏死较为明显，形态结构模糊，上皮脱落，肠腺溶解坏死。电针治疗组大鼠局部结肠组织结构被破坏，部分区域黏膜上皮坏死脱落，固有层内肠腺浅表溶解坏死，坏死区域染色较浅，结构模糊。见图3。2.4神阙穴电针对便秘型肠易激综合征大鼠胃肠功能障碍的影响与空白组比较，模型组大鼠 cGMP 含量、C-fos mRNA表达明显升高（P0.01）；与模型组比较，西沙必利组、电针治疗组大鼠cGMP含量、C-fos mRNA表达明显降低（P0.05），见图4。2.5神阙穴电针对便秘型肠易激综合征大鼠微生物区系Alpha及Beta多样性的影响Alpha多样性指数结果显示，Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数及观察到的物种指数各组间均无明显差异，电针治疗对便秘型肠易激综合征大鼠肠道图1各组大鼠粪便颗粒数、粪便重量、粪便含水量变化注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.01。4607 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 菌群的丰富度及均匀度没有明显影响（图5A）。使用PCA、PCoA以及NMDS图分析了肠道微生物区系Beta多样性的影响，Beta多样性显示各组间无明显交叠趋势，聚类现象较弱（图5B）。图2各组大鼠AWR评分、炭末推进率变化注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.01。图3各组大鼠结肠组织病理变化（HE）图4各组大鼠cGMP含量、C-fos mRNA表达变化注：与空白组比较，*P0.01；与模型组比较，#P0.05。4608 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药胃肠研究2.6神阙穴电针对便秘型肠易激综合征大鼠微生物区系门、属水平的影响在门水平上，在空白组中，粪便样本中菌群门水平最丰富的是拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicuts）；与空白组比较，模型组粪便微生物区系组成有明显的变化，以拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicuts）为主，拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度下降，而厚壁菌门（Firmicuts）丰度增加；与模型组相比，西沙图5各组大鼠肠道微生物区系Alpha多样性及Beta多样性注：A：Alpha多样性；B：Beta多样性；control：空白组；IBS_C：模型组；CI：西沙必利组；ZJ：电针治疗组。图6各分组门、属水平上的物种相对丰度柱形图注：A：各分组门水平上的物种相对丰度柱形图；B：各分组属水平上的物种相对丰度柱形图；control：空白组；IBS_C：模型组；CI：西沙必利组；ZJ：电针治疗组。4609 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 必利组拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度增加，电针治疗组厚壁菌门（Firmicuts）丰度增加（图 6A）。在属的水平上，粪便成分的个体差异增强，空白组以副普氏菌属（Paraprevotella）、普氏杆菌（Prevotella）丰度较高；模型组以乳酸杆菌（Lactobacillus）、异杆菌属（Allobaculum）为主；西沙必利组以乳酸杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）为主；而电针治疗组以乳酸杆菌（Lactobacillus）和梭菌属（Clostridium）为主；其比例在各组间具有可比性。普氏杆菌（Prevotella）丰度在模型组降低，而在西沙必利组丰度升高，电针治疗组可增加乳酸杆菌（Lactobacillus）及梭菌属（Clostridium）丰度（图6B）。3 讨论 IBS-C是功能性胃肠道疾病之一，给个人和社会造成了相当大的经济负担12。中医认为IBS-C为压抑的情绪和担忧会导致肝气郁滞，进而导致肝脏对脾胃的攻击，由此导致的脾虚会影响消化问题。此外，肝气郁结会阻塞经络气血，引起腹痛13。IBS-C的主要症状是腹痛、便秘和乏力，这些都是脾虚证的常见表现14。电针被认为具有改善肝郁脾虚的作用，神阙穴位于脐中，为任脉要穴，与肠腑相隔，具有调胃理肠的功效，于该穴治疗可健运脾胃，因此，本实验采用了神阙穴电针治疗 IBS-C7,15。研究制备了 IBS-C 大鼠模型，结果显示模型组大鼠粪便粒数、粪便含水量及炭末推进率明显降低，符合IBS-C模型特征。报道指出IBS-C大鼠肠黏膜有坏死、糜烂，且有明显的炎性细胞浸润4，本结果显示与其一致。通过电针神阙穴治疗后，大鼠的粪便粒数、粪便含水量及炭末推进率明显升高，结肠组织部分区域黏膜坏死，结肠炎性细胞浸润明显减少，组织病理形态变化明显低于模型组，此外，结肠组织cGMP含量较模型组明显降低。提示神阙穴进行电针治疗可以有效地延缓结肠组织病变程度。肠道菌群是一个复杂的微生态系统，其代谢可能影响肠道免疫反应、养分吸收及能量调节16。此外，细菌修饰肠道是肠道菌群研究的重要领域之一，已被证明其有益于治疗癌症、炎症性肠病、结肠炎、肥胖或其他疾病17-19。IBS-C的确切病因可能是多因素的，近年来越来越多的研究集中到胃肠道微生物区系对IBS-C的影响上20。而关于肠道微生物区系的变化及其影响目前仍知之甚少。研究指出微生物因素在IBS病理生理学中起作用。然而，IBS肠道微生物改变的证据目前有限21。研究报道Alpha多样性和Beta多样性指数分别表征物种在生境内和生境间的多样性，以综合评价其总体多样性，Alpha 多样性以 Chao1、Observed species 指数表征丰富度，以 Shannon、Simpson 指数表征多样性，Chao1值越大代表物种总数越多，Simpson、Shannon指数越大，说明群落多样性越高；Beta多样性指数聚焦于不同生境间多样性的比较，也就是样本间的差异，随着样本数的增加，距离矩阵的维度也不断增大22。既往研究表明紫甘薯多糖能增加小鼠Alpha多样性指数，增强免疫功能，改善小鼠肠道菌群结构23。本研究结果显示 Chao1 指数、Simpson 指数、Shannon指数及观察到的物种指数于各组间均无明显差异，提示神阙穴电针治疗对IBS-C大鼠肠道菌群多样性的改变不明显。然而，传统肠道微生物区系向无菌大鼠转移的研究表明嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）可以促 进 小 肠 转 运24。Shen 等25研 究 发 现 乳 酸 杆 菌（Lactobacillus）增加了小鼠粪便菌群中有益细菌的相对丰度，改善了粪便菌群的结构。本研究结果显示神阙穴电针治疗改善了肠道菌群失调，增加了乳酸杆菌（Lactobacillus）及梭菌属（Clostridium）丰度，维持了肠道菌群的平衡，促进了一些潜在益生菌属（乳杆菌属）的出现。本研究与盐酸洛普酰胺模型大鼠与正常大鼠在肠道菌群多样性和组成上存在显著差异的结果一致26。研究认为肠道微生物区系与肠道通透性增加密切相关，根据脑-肠轴理论，当脑屏障被破坏时肠屏障也被破坏，从而影响肠道营养吸收及动力27。C-fos是即刻早期基因的一种，C-fos的基因功能是通过其所编码的核蛋白Fos实现的，多种刺激诱导可使Fos快速表达28。研究表明IBS-C由于内脏高敏感性，经常有腹痛、腹胀等刺激，使C-fos处于高表达状态29，本研究结果中模型组大鼠 C-fos mRNA表达明显升高，与其报道一致。此外，报道证实IBS-C大鼠脑干上行转导通路上多个部位的C-fos表达升高，提示IBS-C发病过程中高级神经中枢可通过C-fos参与刺激信号调控30。Muller等31研究显示肠道微生物群可以调节肠道外交感神经元，虽然微生物区系消耗导致C-Fos表达增加，但用短链脂肪酸产生菌对无菌小鼠进行定植可以抑4610 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia