设施根结线虫发病与未病土壤真菌多样性比较_秦立金.pdf

1引言番茄属于茄科番茄属，又名西红柿、番柿、洋柿子等，在国外有“金苹果”“爱情果”等美誉1。由于管理等问题，导致番茄根结线虫病害日益严重。根结线虫（Meloidogyne spp.）是一种在全世界发生和分布的植物内寄生线虫，寄主种类达到3000多种，严重威胁着世界农业的安全生产2在我国，根结线虫发生范围广，发病率高，防治困难，已成为严重阻碍我国农业生产的一大病害，每年因根结线虫造成经济损失巨大3。根结线虫病是危害番茄的主要土传病害之一，并且根结线虫的入侵会使植物根系形成根结，其他病害更容易侵染，严重影响番茄的品质。土壤中存在各种各样的微生物群体，它们对土壤有机质分解、养分循环、土壤结构、植物生长发育以及整个生态平衡都具有重要作用4。真菌是有机物质分解和土壤生物量的主要组成部分,在农业生态系统中起着重要的作用5。有关土壤真菌多样性的研究已见报到，李天来6发现番茄连作后改变了土壤真菌种群平衡，这可能是导致番茄产生连作障碍的重要原因之一。王澎7等人发现施用有机氮(Gly)肥在一定程度上可以提高真菌的多样性，提高抗病原菌数量。以上研究在一定程度上都表明了发病与真菌多样性有关。本试验拟测定设施番茄根结线虫发病与未发病土壤的真菌多样性指标，分析其在界、门、纲、目、科、属水平的多样性变化，找出发病与未发病土壤的真菌多样性差异，为以后根结线虫病的有效防控提供理论依据。2材料与方法2.1实验材料设施根结线虫发病与未病土壤真菌多样性比较秦立金1，刘铭2，李艳丽2，刘凯炎3，陈凡凡3，祝海颖3，陆鸣3，庞文敏3，张志洁3，刘海婷3（1.赤峰学院农学院；2.赤峰市农牧业综合检验检测中心；3.赤峰学院化学与生命科学学院，内蒙古赤峰024000）收稿日期：2022-09-07通讯作者：刘铭（1984-），男，本科，农艺师，研究方向为农产品质量安全，。基金项目：由2022年赤峰市自然科学科研课题（SZR2022014）；赤峰市第二批“玉龙英才”工程产业创新创业人才团队（土传病害生物防治创新人才团队）；2020年内蒙古自治区自然科学基金（2020MS03073）；2018年自治区科技重大专项项目（zdzx2018009）；赤峰学院2021年度大 学 生 创 新创 业 训 练 计 划 项 目（2021101038001）；赤峰学 院 一流学 科建设 项目（CFXYYLXKB202102）资助；赤峰学院经济作物营养与健康实验室、赤峰学院区域生态保护与农牧业发展重点实验室支持摘要：为了了解设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌多样性差异，本实验分别对设施番茄发病、未发病老棚以及未发病新棚的土壤采样，利用高通量ITS方法测定土壤真菌多样性。结果表明，设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌多样性不同，在界门水平上，真菌界相对丰度为100.00%，发病与未发病土壤差异不显著；共检测出2个菌门，未发病老棚土壤的Basidiomycota/担子菌门为未发病新棚的9.69倍；共检测出5个菌纲，未发病老棚Leotiomycetes/锤舌菌纲和Agaricomycetes/伞菌纲为未发病新棚的5.32倍和10.04倍，发病土壤与未发病老棚土壤的Dothideomycetes/座囊菌纲为未发病新棚的17.84倍和22.87倍；共检测出9个菌目，发病土壤与未发病老棚土壤的Pleosporales/腔菌目绝对丰度为未发病新棚的17.84倍和22.87倍；共检测出13个菌科，发病土壤Psathyrellaceae/水蕨科绝对丰度为未发病新棚的9.13倍，未发病老棚Inocybaceae/丝盖伞科绝对丰度为未发病新棚的4.81倍；共检测出7个菌属，发病土壤Coprinel-lus/鬼伞属为未发病新棚的9.13倍，未发病老棚土壤的Inocybe/丝盖伞属为未发病新棚的4.81倍。因此，设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌多样性不同，且发病和未发病老棚土壤高于未发病新棚。关键词：根结线虫；日光温室；番茄；土壤；真菌多样性中图分类号：Q945.8文献标识码：A文章编号：1673-260X（2023）01-0005-07Vol.39 No.1Jan.2023赤 峰 学 院 学 报（自 然 科 学 版）Journal of Chifeng University(Natural Science Edition)第39卷第1期2023年1月5-DOI:10.13398/ki.issn1673-260 x.2023.01.023设施番茄发病、未发病棚室土壤采自内蒙古赤峰市翁牛特旗杨营子设施番茄棚室。2.2实验设计上茬番茄拉秧时，对设施番茄发病与未发病棚室进行土壤取样，每个棚室采集土壤3份；采样时间为上茬番茄拉秧时，同时，调查根结线虫发病率及病情指数；采集回的土样及时处理，过1mm筛，标记，-80摄氏度冰箱冷冻，待送检；对测得的ITS真菌多样性数据进行显著性检验和分析。2.3ITS测序实验流程将田间采集的土壤样品利用OMEGA的试剂盒提取土壤DNA。对提取到的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测，查看基因组DNA的完整度与浓度。利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。ITS测序使用的文库构建步骤遵循Illumina测序仪文库构建方法。从基因组DNA样品开始，整个ITS测序具体步骤如下：本次测序以ITS2为目标区域进行引物设计，引物序列为fITS7GTGARTCATCGAATCTTTG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC。使用DNA模板50ng，25uL的PCR体系，使用Phusion酶扩增2535个循环。一轮PCR扩增反应之后，在正反向引物两端分别加上不同的barcodes，再进行下一轮扩增。扩增完成的PCR产物使用beads纯化之后进行上 机 测 序。PCR产 物 用AxyPrepTM Mag PCRNormalizer做归一化处理。构建好的文库上样到cBot或簇生成系统，利用Illumina MiSeq测序仪进行2x300bp paired-end测序。对于MiSeq测序获得的双端数据，首先根据barcode信息进行样品区分，然后根据overlap关系进行merge拼接成tag，接着对拼接完成的数据进行数据过滤，随后进行Q20、Q30等质控分析。对最终获得clean数据进行OTU聚类分析和物种分类学分析。2.4实验数据采用IBM SPSS26.0对数据进行平均数标准差计算和成对数据t检验。3结果和分析3.1界水平差异设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌界水平绝对和相对丰度差异比较见表1和表2，发病土壤的Fungi/真菌界与未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2未达到差异显著（P0.05），未发病老棚/CK1分别比发病/Ne和未发病新棚/CK2提高了9.62%和25.00%。菌界发病土壤/Ne未发病老棚土壤/CK1未发病新棚土壤/CK2Fungi/真菌界80164.337340.67a87877.676056.71a70298.3312069.38aunclassified0.000.000.00注：不同小写字母代表横行0.05水平差异显著，以下同。表1根结线虫发病与未发病土壤真菌界水平绝对丰度差异比较3.2门水平差异比较设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌门水平绝对和相对丰度差异比较见表3和表4，发病土 壤 的/NeAscomycota/子 囊 菌 门 和Unspecified_Fungi/未指明真菌与未发病老棚/CK1和未发病新棚/CK2未达到差异显著(P0.05)，Ascomycota/子囊菌门和Unspecified_Fungi/未指明真菌在未发病老棚/CK1相对丰度分别可达78.24%和3.56%（见表菌界发病土壤/Ne未发病老棚土壤/CK1未发病新棚土壤/CK2Fungi/真菌100.000.00100.000.00100.000.00Unclassified/未分类0.000.000.000.000.000.00表2根结线虫发病与未发病土壤真菌界水平相对对丰度差异比较菌门发病土壤/Ne未发病老棚土壤/CK1未发病新棚土壤/CK2Ascomycota/子囊菌门68578.002271.54a6902514088.34a66422.3311352.41aBasidiomycota/担子菌门8684.004918.62ab15699.6710680.70a1620.671423.98bUnspecified_Fungi/未指明2902.33322.00a3153.00737.68a2255.33640.08a表3根结线虫发病与未发病土壤真菌门水平绝对含量差异比较绿色发展论坛6-4），而在未发病新棚/CK2相对丰度分别为94.94%和3.35%。发病土壤/Ne的Basidiomycota/担子菌门与未发病老棚/CK1和未发病新棚/CK2未达到差异显著(P0.05)，但未发病老棚/CK1和未发病新棚/CK2达到差异显著(P0.05），但未发病老棚土壤/CK1与未发病新棚土壤/CK2差异显著（p0.05），但与未发病新棚土壤/CK2差异显著，（p0.05）（见表5），其中，Unspecified_Fungi/未指明绝对和相对丰度占据较大比例，在3种土壤中，相对丰度分别可达74.09%、菌门发病土壤/Ne未发病老棚土壤/CK1未发病新棚土壤/CK2Ascomycota/子囊菌门85.854.9678.2411.9494.491.67Basidiomycota/担子菌门10.535.0518.1912.462.161.56Unspecified_Fungi/未指明3.620.293.560.593.351.44表4根结线虫发病与未发病土壤真菌门水平相对含量差异菌纲发病土壤/Ne未发病老棚土壤/CK1未发病新棚土壤/CK2Leotiomycetes/锤舌菌纲10953.67781.19ab31868.3318674.04a5988.331938.52bAgaricomycetes/伞菌纲8534.004911.85ab15577.0010660.61a1552.001412.86bDothideomycetes/座囊菌纲1481.00573.36a1898.33556.24a83.0057.97bLecanoromycetes/茶渍纲8.679.87a1.001.73a1.001.73aSordariomycetes/子囊菌纲7.008.89a0.000.00a2.003.46aUnspecified_Fungi/未指明59180.002685.18a38533.004586.90b62672.009158.22a表5根结线虫发病与未发病土壤真菌纲水平绝对丰度差异比较菌纲发病土壤/Ne未发病老棚土壤/CK1未发病新棚土壤/CK2Leotiomycetes/锤舌菌纲13.711.1235.5718.478.401.84Agaricomycetes/伞菌纲10.345.0618.0512.432.061.56Dothideomycetes/座囊菌纲3.620.293.560.593.351.44Lecanoromycetes/茶渍纲0.010.010.000.000.000.00Sordariomycetes/子囊菌纲0.010.010.000.000.000.00Unspecified_Fungi/未指明74.095.0544.228.1789.412.36表6根结线虫发病与未发病土壤真菌纲水平相对丰度差异比较44.22%和89.41%。3.4目水平差异比较设施番茄根结线虫发病与未发病土壤真菌目水平绝对和相对丰度差异见表7和表8，发病土壤/Ne的Agaricales/伞菌目、Cantharellales/鸡油菌目、Helotiales/柔 膜 菌 目、Rhytismatales/斑 痣 盘 菌 目、绿色发展论坛7-Hypocreales/肉 座 菌 目、Ostropales/厚 顶 盘 目、Hy-menochaetales/锈革孔