山羊支原体山羊肺炎亚种MC...及其编码氨基酸的生物学分析_刘威.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):3 5-4 0P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e山羊支原体山羊肺炎亚种MC C G-0 5 2 1乳酸脱氢酶基因的克隆表达及其编码氨基酸的生物学分析刘 威1,蒋鹏程1,2,杨克礼1,袁芳艳1,周丹娜1,刘泽文1,高 婷1,郭 锐1,孙 裴2*,田永祥1*(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室,湖北武汉4 3 0 0 6 4;2.安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥2 3 0 0 3 6)摘 要:旨在获得山羊支原体山羊肺炎亚种MC C G-0 5 2 1乳酸脱氢酶(L-l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e,L DH)的蛋白表达产物,分析其编码氨基酸的生物学特性,为进一步研究L DH蛋白的功能奠定基础。试验完成了L DH基因的克隆和密码子改造,成功将L DH基因中4 7 3、7 6 1、7 7 9n t处的A突变为G,使改造后的L DH基因能在大肠埃希氏菌R o s e t t a中正确表达。S D S-P AG E电泳结果显示,I P T G诱导目的蛋白表达后获得一条大小约3 4k u的蛋白条带,W e s t e r nb l o t结果表明获得的原核表达产物可与抗6H i st a g的单克隆抗体发生特异性反应,研究采用D NA S t a rP r o t e a n模块分析了L DH的二级结构、蛋白骨架柔性区域和可能的B细胞抗原优势表位,为进一步研究其功能奠定了基础。关键词:山羊支原体山羊肺炎亚种;MC C G-0 5 2 1;乳酸脱氢酶;密码子改造;二级结构中图分类号:S 8 5 2.6 2文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 3 5-0 6 山羊传染性胸膜肺炎(C o n t a g i o u s c a p r i n ep l e u-r op n e u m o n i a,C C P P)是山羊的一种急性或慢性高度接触性传染病,感染羊常发生高热、胸外膜炎和纤维素性肺炎等症状1-2,世界动物卫生组织(WOAH)收稿日期:2 0 2 2-0 2-1 7 基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 1 6 Y F D 0 5 0 1 5 0 6);湖北省农业科技创新中心资助项目(2 0 1 9-6 2 0-0 0 0-0 0 1-1 7)作者简介:刘 威(1 9 8 5-),男,湖北武汉人,副研究员,博士,主要从事动物传染病研究工作。*通讯作者E s t a b l i s h m e n t o fR e v e r s eG e n e t i cP l a t f o r mo fN e w c a s t l eD i s e a s eV i r u sS t r a i nM u k t e s w a rWE I J i a-y a n g1,2,L IL i2,WANGG u o-k a n g2,XUY i n g-y i n g2,Z E NGZ h e2,L UOQ i n g-p i n g2,S HAO H u a-b i n2,WE NG u o-y u a n2,S HANGY u2,P ANZ i-s h u1(1.C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e,W u h a nU n i v e r s i t y,W u h a n,H u b e i,4 3 0 0 7 2,C h i n a;2.K e yL a b o r a t o r yo fP r e v e n t i o na n dC o n t r o lA g e n t s f o rA n i m a lB a c t e r i o s i s,M i n i s t r yo fA g r i c u l t u r ea n dR u r a lA f f a i r s&H u b e iP r o v i n c i a lK e yL a b o r a t o r yo fA n i m a lP a t h o g e n i cM i c r o b i o l o g y,I n s t i t u t eo fA n i m a lH u s b a n d r ya n dV e t e r i n a r y,H u b e iA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,W u h a n,H u b e i,4 3 0 0 6 4)A b s t r a c t:I no r d e r t oe s t a b l i s ht h er e v e r s eg e n e t i cs y s t e mo fN e w c a s t l ed i s e a s ev a c c i n es t r a i nM u k t e s w a r,n i n ep a i r so fp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c eo fM u k t e s w a rs t r a i n,a n dn i n ef r a g-m e n t sw e r eo b t a i n e db yP C Ra m p l i f i c a t i o n.T h en i n ef r a g m e n t sw e r ef u s e da n di n s e r t e di n t ov e c t o rp A C-N R-T 7,a n dt h ef u l l-l e n g t hc D NAc l o n i n gp l a s m i dp A C-M u k t e s w a ro fM u k t e s w a rs t r a i nw a so b t a i n e d.p A C-M u k t e s w a rw a sc o-t r a n s f e c t e dw i t ht h r e es u p p o r t i n gp l a s m i d s(p VA X-N P,p VA X-Pa n dp c D NA-L)i n t oB HK-2 1c e l l sp r e-i n o c u l a t e dw i t hv T F 7-3,a n dt h er e c o m b i n a n tv i r u sr M u k t e s w a rw a ss u c c e s s f u l l yr e s c u e df r o mB HK-2 1c e l l s.T h er e s u l t so f t h eb i o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o ns h o w e dt h a t r M u k t e s w a rh a dt h es a m ep r o l i f e r a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n dv i r u l e n c ea s i t sp a r e n t a l s t r a i n.I nc o n c l u s i o n,t h e r e v e r s eg e n e t i cs y s-t e mo f t h ev a c c i n e s t r a i nM u k t e s w a rw a s s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d,w h i c hw a sv a l u a b l e f o r f u t u r ed e v e l o p i n go fN e w c a s t l ed i s e a s ev e c t o rv a c c i n e sw i t hw i t hh i g he f f i c i e n c ye x p r e s s i o no f e x o g e n o u sp a t h o g e np r o t e i n s.K e yw o r d s:N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s;M u k t e s w a rs t r a i n;r e v e r s eg e n e t i cs y s t e mDOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.016将其列为法定报告动物传染病3。山羊支原体山羊肺炎亚种(M y c o p l a s m ac a p r i c o l u ms u b s p.c a p r i-p n e u m o n i a e,M c c p)是引起C C P P的常见病原体之一4。M c c p最早在肯尼亚从急性感染胸膜肺炎的山羊中被分离得到5,随后阿曼、阿联酋、埃塞俄比亚、尼日尔、突尼斯、土耳其、苏丹、乍得等国家均报道成功分离M c c p,我国2 0 0 7年首次成功分离,用病原学方法证实为C C P P病原6。近年在我国河南、新疆、黑龙江、甘肃、内蒙古、湖北等1 6个省或自治区均报道有C C P P病例,是影响我国山羊产业发展的重大疾病之一7-8。山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体丝状亚种S C型、山羊支原体山羊亚种、丝状支原体丝状亚种L C型和丝状支原体山羊亚种均属于丝状支原体簇,簇成员之间血清学性质相似,引起的临床症状也十分类似9-1 4。针对该病病原复杂、临床鉴别难的特点,建立一种敏感、特异的M c c p检测方法尤为重要,诊断靶标的挖掘是检测方法建立的关键。研究表明,猪肺炎支原体P 3 6乳酸脱氢酶(L-l a c t a t ed e-h y d r o g e n a s e,L DH)蛋白存在决定种属特异性的抗原决定簇1 5,是猪肺炎支原体的一个重要诊断靶标,广泛应用在猪肺炎支原体的血清学诊断方法中。研究表明,利用P 3 6建立的猪肺炎支原体血清学检测方法,在检测猪絮状支原体、猪鼻支原体、猪圆环病毒时不存在交叉反应1 6,抗P 3 6的多克隆抗体与近源菌株也没有交叉反应,表现出了很高的种属特异性1 7。山羊支原体山羊肺炎亚种的L DH还未见报道。本研究以编码M c c pL DH的MC C G-0 5 2 1基因为研究对象,拟采用生物信息学方法分析M c c pL DH的特性,对L DH基因进行密码子优化后构建L DH的原核表达载体,以期获得L DH的原核表达产物,为进一步研究其功能奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株、基因组D NA及载体 大肠埃希氏菌DH 5、B L 2 1(D E 3)、R o s e t t a,天根生化科技(北京)有限公司产品;原核表达质粒p E T-3 0 a(+)由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保存;山羊支原体山羊肺炎亚种(M c c p)8 7 0 0 1基因组D NA由中国兽医药品监察所惠赠。1.1.2 主要试剂 羊抗鼠I g G和鼠源抗H i s-t a g单克隆抗体,武汉三鹰生物技术有限公司产品;E C L底物化 学 发 光 显 色 试 剂,T h e r m o公 司 产 品;N i-NT AA g a r o s e,G E公司产品;快速定点突变试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司产品;D NA聚合酶、T 4连接酶、核酸内切酶,T