山羊源牛无浆体对Balb_c小鼠感染性研究_彭永帅.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):6 7-7 1P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e山羊源牛无浆体对B a l b/c小鼠感染性研究 收稿日期:2 0 2 2-0 3-1 0 基金项目:河南省科技攻关计划项目(2 1 2 1 0 2 1 1 0 3 5 7);河南省高等学校重点科研项目(2 3 B 2 3 0 0 1 1);河南牧业经济学院博士科研启动资金资助(2 0 2 2 HNUAHE D F 0 0 8)作者简介:彭永帅(1 9 8 6-),男,河南滑县人,讲师,博士,主要从事蜱和蜱传病原微生物研究。*通讯作者彭永帅1,2,张 曼1,张 艳1,菅复春2,王海燕1,宁长申2*(1.河南牧业经济学院,河南郑州4 5 0 0 4 6;2.河南农业大学,河南郑州4 5 0 0 4 6)摘 要:牛无浆体(A n a p l a s m ab o v i s)隶属无浆体属(A n a p l a s m a),可感染动物单核细胞和组织巨噬细胞,对动物生产性能影响较大。用单核细胞分离方法得到山羊源牛无浆体,并将其接种至人工饲养的B a l b/c小鼠,接种时分别设置高、中、低剂量组、阴性对照和空白对照。结果发现,高剂量组和中剂量组接种后3、6、9d的血涂片检查和P C R扩增均可查到牛无浆体,9d后转阴;低剂量组B a l b/c小鼠不同时间点检查时牛无浆体均呈阴性。表明从山羊单核细胞直接分离牛无浆体可以感染B a l b/c小鼠,接种9d内可持续感染,为牛无浆体的动物感染模型的建立奠定了基础。关键词:牛无浆体;B a l b/c小鼠;人工接种;动物模型中图分类号:S 8 5 2.6 4文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 6 7-0 5 牛无浆体(A n a p l a s m ab o v i s)隶属于立克次体目(R i c k e t t s i a l e s)、无浆体科(A n a p l a s m a t a c e a e)、无浆体属(A n a p l a s m a),1 9 3 6年首次在牛体内被发现,可感染血液单核细胞和组织巨噬细胞,大小1m6m,在单核细胞中表现多种包涵体形态,其中最常见的是小型(0.5m1m)和中型(2m3m)球状体,而成熟包涵体(3m6m)较少见1。牛和水牛被认为是牛无浆体的主要宿主,后来在山羊、犬、狍子、马鹿、梅花鹿、獐、巴西的短角鹿、黄羊、豹猫、浣熊和棉尾兔等体内也被发现2。很多蜱类被怀疑可以传播牛无浆体,包括璃眼蜱属、花蜱属、扇头蜱属、血蜱属等1。牛无浆体主要分布在非洲、亚洲和南美洲,但它也在美国和欧洲南部被发现3-4。感染牛无浆体的动物一般表现轻微临床疾病,但也有报道可导致发热、虚弱、体重减轻、黏膜苍白和淋巴结炎等比较严重的临床症状1,对动物生产性能影响较大。近年来,随着人们对牛无浆体的持续关注,其在我国多种动物中的流行呈上升趋势。然而,目前关于牛无浆体的研究一直停留在流行病学调查水平,其对动物的致病性、疫苗研发、药物治疗等领域一直存在空白。因此,开展牛无浆体的分离鉴定及探索一种实验动物模型对该病原体的研究具有重要推动作用。对无浆体的检测主要依赖于血液样本的显微镜检查和P C R检测技术相结合 的方法。牛无浆体1 6 Sr R NA和g r o E L基因是公认的用于检测该病原的目的基因5。本研究旨在将分离的1株牛无浆体接种 至 人 工 饲 养 的B a l b/c小 鼠,验 证 该 菌 株 对B a l b/c小鼠的感染性,为牛无浆体B a l b/c小鼠动物模型的建立奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集 用E D T A-N a2抗凝采血管采集购自河南洛阳某羊场的山羊颈静脉血2 0m L,4保存备用。1.1.2 实验动物 B a l b/c健康小鼠购自郑州大学实验动物中心,6周龄8周龄,体重2 0g2 2g,雌雄各半,饲养于河南牧业经济学院清洁级动物房,饲养方式为自由采食、自由饮水。将B a l b/c小鼠随机分为9组,每组5只。1.1.3 主要仪器设备 P C R仪,美国A B I公司产品;荧光定量P C R仪,德国耶拿公司产品;超微量紫外分光光度计,美国T h e r m oF i s h e r公司产品;光学显微镜,日本奥林巴斯公司产品。1.1.4 主要试剂 羊外周血单核细胞分离液试剂盒,天津灏阳生物公司产品;血液D NA提取试剂盒,美国OME GA公司产品;L aT a q酶和S Y B RP r e m i xT a q和p MD-1 8 T,日本T a K a R a公司产品;大肠埃希氏菌DH 5 感受态细胞和S a n P r e p柱质粒DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.013提取试剂盒,上海生工生物工程股份有限公司产品;姬姆萨原液,北京索莱宝科技有限公司产品。1.2 方法1.2.1 单核细胞分离 取血液样品2m L,参照羊外周血单核细胞分离液试剂盒操作说明分离山羊单核细胞。1.2.2 D NA提取 参照血液D NA提取试剂盒操作说明对3 0 0L全血或分离得到的单核细胞进行D NA提取,所得D NA置于冰箱-2 0保存备用。1.2.3 病原鉴定及定量检测 分别基于牛无浆体1 6 Sr R NA和g r o E L基 因 位 点 对 病 原 进 行 常 规P C R(c o n v e n t i o n a lP C R,c P C R)鉴定,同时为了排除不同无浆体种的混合感染,分别对山羊无浆体、绵羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、边缘无浆体、扁平无浆体和中央无浆体进行检测(表1),并将P C R阳性产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序,测序结 果 在N C B I网 站(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/)进行比对分析;用实时荧光定量P C R(q P C R)对病原进行定量。c P C R反 应 总 体 系:1 0L ab u f f e r2.5L,d NT P s4L,上、下游引物(2 0m o l/L)均0.5L,L aT a q酶0.2 5L,D NA模板2L,灭菌纯水补足至2 5L。P C R反应条件:9 45m i n;9 43 0s,退火3 0s(表1),7 2延伸3 0s,3 5个循环;最后7 2再延伸1 0m i n。q P C R反应体系:S Y B RP r e m i xT a q1 2.5L,上、下游引物各0.5L,D NA模板2L,加灭菌双蒸水补足至2 0L。P C R反应条件:9 53 0s;9 55s,5 73 0s,3 0个循环。表1 P C R引物信息及退火温度T a b l e1 T h e i n f o r m a t i o no fP C Rp r i m e r sa n da n n e a l i n gt e m p e r a t u r e病原类型P a t h o g e nt y p e目的基因T a r g e tg e n e序列5 -3 P r i m e r s e q u e n c e(5 -3)退火温度/A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e片段长度/b pF r a g m e n tl e n g t h参考文献R e f e r e n c e牛无浆体-c P C RA.b o v i s-c P C R1 6 Sr R NAC T C G T A G C T T G C T A T GA GAA CT C T C C C G GA C T C C A G T C T G5 85 5 15g r o E LG T G G GA T G T A C T G C T G GA C CAT G G G GA GA GA TA T C C G C GA6 15 2 9本研究设计牛无浆体q P C RA.b o v i s-q P C Rg l t AAG G T G C A G C T G C G T T A T G G G GT G T C C C G C T C T T G C C G T C T T T G6 01 3 36山羊无浆体A.c a p r am s p4G G G T T C T GA T A T G G C A T C T T CG G GAAA T G T C C T T A T A G GA T T C G5 36 5 67绵羊无浆体A.o v i sm s p4T GAA G G GA G C G G G G T C A T G G GGA G T AA T T G C A G C C A G G C A C T C T6 33 4 78嗜吞噬细胞无浆体A.p h a g o c y t o p h i l u m1 6 Sr R NAAG T G C T GAA T G T G G G GAT AA T T T A T C T C C G T GC T AAT C T C C A T G T C AAG GA G T G G T AA G G T T T6 31 7 29边缘无浆体A.m a r g i n a l em s p1aC A C C G G G T A C G C C A C C T A T C T C G CAA C AA G C T G T G T A G T A G T G T C C GAA G G6 21 3 0 01 0扁平无浆体A.p l a t y s1 6 Sr R NAGA T T T T T G T C G T A G C T T G C T A T GT AG C A C T C A T C G T T TA C A G C5 66 7 81 1中央无浆体A.c e n t r a l e1 6 Sr R NAC T G C T T T T AA T A C T G C A G GA C T AAT G C A G C A C C T G T G T GA G G T6 24 2 61 2 为了利用q P C R对牛无浆体的接种浓度进行绝对定量,构建包含牛无浆体g l t A基因的质粒,用于构建标准曲线。将P C R产物(1 3 3b p)克隆到p MD-1 8 T,然后转化至大肠埃希氏菌DH 5 感受态细胞。使用S a n P r e p柱质粒提取试剂盒从转化大肠埃希氏菌DH 5 感受态细胞中提取质粒D NA,用超微量紫外分光光度计检测D NA浓度,大于2 0n g/L可用于下一步试验。为了生成定量测定的标准曲线并评估扩增效率,以1 0倍倍比稀释(1 00n g/L1 01 0n g/L)的质粒D NA作为模板进行扩增。每份稀释液在-2 0条件下保存备用,为了减少污染的可能性,标准质粒D NA被储存在一个单独的冷冻箱。1.2.4 病原接种 将不同浓度的牛无浆体采用腹腔接种方法接种至正常饲养的B a l b/c小鼠,接种时每组内分别设置阴性对照,接种时按照高(初浓度)、中(1/2浓度)、低(1/4浓度)剂量进行,每组设置3个重复,阴性对照分别注射等剂量的生理盐水。1.2.5 B a l b/c小鼠牛无浆体感染情况检测 1.2.5.1 B a l b/c小鼠血液样品采集 用断尾法采集人工感染后3、6、9、1 2、1 5d的B a l b/c小鼠血液,每次采集血液样品量约为3 0 0L,现场制作血涂片,剩余血液样品置冰箱4保存备用。1.2.5.2 血涂片检查 将制作好的血涂片用甲醇固86动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)定2m i n 3m i n,再用姬姆萨原液与磷酸盐缓冲液配置的姬姆萨工作液染色1 5m i n3 0m i n,用蒸馏水缓慢冲洗,室温晾干后在光学显微镜10 0 0倍镜下观察,并拍照记