桑葚花青素的提取及其脂质体的制备_赖俊余.pdf

2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 75 桑葚花青素的提取及其脂质体的制备桑葚花青素的提取及其脂质体的制备 赖俊余，赵镕，温燕梅，郑超*(广东海洋大学 化学与环境学院，广东 湛江 524000)摘 要确定黑桑葚脂质体的最佳制备工艺，研究其表征与评价，探究桑葚花青素脂质体应用于开发天然植物绿色染发剂产品的实现。提取桑葚花青素，采用逆向蒸发法和 pH 梯度法制备花青素脂质体，采用单因素实验考察大豆卵磷脂与胆固醇质量比(为 14、15、16、17、18)、溶解壁内膜有机溶剂的种类(乙醚、石油醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、乙醚乙醇=11)、桑葚花青素冻干粉加入量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)对包封率的影响；为优化以得到最佳的桑葚花青素脂质体制备工艺条件，设计桑葚花青素冻干粉加入量(1.0、1.5、2.0 mg/L)、胆固醇与卵磷脂的质量比值(15、16、17)及溶解壁内膜脂有机溶剂的种类(二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚)三因素三水平实验，确定花青素脂质体的最佳制备工艺，对该工艺制得的脂质体进行表征。得到桑葚花青素脂质体最佳制备工艺条件为以乙醚为溶解膜脂的有机溶剂、桑葚花青素冻干粉的加入量为 1.5 mg/mL(即 18 mg)、胆固醇与卵磷脂的质量比值为 15。在最佳制备工艺条件下进行验证性实验，得到所制备花青素脂质体包封率达 72.23%。关键词桑葚；花青素；提取；脂质体；包封率 中图分类号S642.2 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)04-0075-06 Extraction of Anthocyanin from Mulberry and Preparation of Liposome Lai Junyu,Zhao Rong,Wen Yanmei,Zheng Chao*(Faculty of Chemistry and Environmental Science,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524000,China)Abstract:To determine the best preparation process of black mulberry liposome,study its characterization and evaluation,and explore the realization of application of mulberry anthocyanin liposome in the development of natural plant green hair dye products.Extract mulberry anthocyanins,prepared by reverse evaporation method and pH gradient anthocyanins liposomes,adopt single factor experiment investigation quality of soybean lecithin and cholesterol than(1,15,16,17,18),dissolving wall lining the kinds of organic solvents(ether,petroleum ether,chloroform,dichloromethane,ethanol,ethyl acetate,ethyl ether,Ethanol=11),mulberries anthocyanin freeze-dried powder dosage(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/mL)on the encapsulation rate;In order to optimize and obtain the optimal preparation conditions of mulanthocyanin liposomes,a three-factor and three-level experiment was designed,including the addition amount of mulanthocyanin freeze-dried powder(1.0,1.5,2.0 mg/L),the mass ratio of cholesterol to lecithin(15,16,17)and the types of organic solvents(dichloromethane,trichloromethane,ether)to dissolve the inner wall lipid.The optimum preparation process of anthocyanin liposome was determined and the liposome prepared by this process was characterized.The optimum preparation conditions were obtained as follows:ether was used as the organic solvent to dissolve membrane lipid,the dosage of mulanthocyanin freeze-dried powder was 1.5 mg/mL(18 mg),and the mass ratio of cholesterol to lecithin was 15.The encapsulation efficiency of the prepared anthocyanin liposome was 72.23%.Keywords:mulberry；anthocyanin；extraction；liposome；encapsulation efficiency 桑葚又称为桑枣、桑果、桑椹，为桑科落叶乔木桑树的成熟果穗，色泽诱人，味甘性寒，酸甜多汁，风味独特，是人们日常水果之一；具有清除自由基、消炎、解酒抑菌、抗肿瘤、增强免疫力等药理功效。成熟桑葚含有丰富的花色苷化合物，为植物水溶性色素，其为黄酮类物质，是桑葚的主要成分，营养价值较高，也可作为食用色素(桑葚色素结构如图 1 所示)。花色苷具有调节血糖、抗氧化、延缓衰老、预防老年痴呆症及治疗癌症的作用。桑葚中含有大量的天然花青素(红色素)，自然条件下游离存在的花青素极少，大多与糖基结合以糖苷形式存在而形成花色苷1。花色苷属于 2-苯基苯并吡喃(即花色素母核)阳离子的衍生物，基本碳链骨架为 C6-C3-C6，其中 A 环与 B 环都具有羟基官能团结构；且花色苷显现颜色与两个环上所连基团的种类与数量相关，当环上所连羟基官能团较多时则颜色偏蓝色，当所连甲氧基官能团较多时则颜色偏红色2。花青素颜色随水溶液 pH 变化而变化，在 pH 值 3.513.0 范围内由鲜红色逐渐变为蓝黑色。这些花青素分子中含有许多羟基，易溶于水、甲醇、乙醇等极性较大的有机溶剂，不溶于丙酮、石油醚等极性较小的有机溶剂中，故可用不同配比的乙醇-水溶剂提取桑葚中的花青素。且由于花青素的结构上连接有许多酚羟基官能团，可以保护植物中其他有效成分不被氧化而失效，具有较强的自由基清除能力。花青素具有较长的共轭体系，在酸性水溶液中可见光光区最大吸收波长一般在 520 nm左右。花色苷较不稳定，在长时间的光照下会发生分解并褪色，且在高温或有氧的条件下都会加快该分解反应，而在低温无氧的环境下该反应减慢。故花色苷及其配制的溶液在使用与贮存时都应该尽量在低温、避光、无氧环境3-9。图图 1 桑葚花青素结构图桑葚花青素结构图 Fig.1 Structure diagram of anthocyanin in Mulberry 脂质体，又称为类脂小球，是指将有效药物(极性或者非极性)包封于单层或者多层(每层厚度约 4 nm)的类脂质双分子层内而形成的亲水性封闭微型囊泡。1965 年英国研究学者Banghman 首次成功制备脂质体；1971 年英国 Rymen 等人开始将脂质体应用于药物载体；而我国自 80 年代开始进行脂质体制备及其应用的研究工作10-11。脂质体可由磷脂(包括卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等)、胆固醇等作为膜材制备而成，此两种成分是构成稳定脂质体双分子膜层的关键物质。脂质体具有同生物膜相类似的脂质双分子膜层结构，无生物毒性且无免疫活性，有着较好的细胞亲和性与生物相容性；脂质体通过非共价键结合的形式包裹药物，该包裹方式有利于药物的释放；被脂质体所包含的药物可降低其对非靶向器官的药物毒性，也可提高药物的稳定与增强药物治疗效果；但一般情况下，所制备的脂质体的物理化学性质稳定较差，所包封的药物较易渗漏，故对包裹着药物的脂质体的生产及储存有着较高的要求。由类双分子层构成的脂质体的中心区域与由表面活性剂所组成的单分子层胶团不同，脂质体为水相中心区域，可容纳极性药物，而胶团为油相中心区域，可容纳非极性药物。常用的脂质体制备方法主要分为设备收稿日期 2022-09-06 作者简介 赖俊余(1999-)，男，广东揭阳人，学士，主要研究方向为药物化学。*为通讯作者。广 东 化 工 2023 年 第 4 期 76 第 50 卷 总第 486 期 强化法与物理制备法，设备强化法包括超声波分散法、冷冻干燥法，物理法包括薄膜分散法、逆相蒸发法、pH 梯度法、乙醇注入法等方法12-13。本文以大豆卵磷脂和胆固醇为壁材，以包封率为考察指标，首先对桑葚花青素脂质体的制备进行单因素条件优化，在此基础上采用三因素三水平的正交实验，确定制备桑葚花青素脂质体的最佳工艺条件。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与仪器 桑葚，合肥花开花果商贸有限公司；AB-8 大孔吸附树脂，上海源叶生物科技有限公司；卵磷脂(纯度98%)，上海麦克林生化科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。TF-FD-1 冷 冻 干 燥机，上海田枫实业有限公 司；PX124ZH(120 g/0.1)分析天平，奥豪斯中国地区；GT SONIC-P6超声波清洗器，广东固特超声股份有限公司；TG16G 台式离心机，河南北弘实业有限公司；H1650R 低温高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；RE-52AA 水浴旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；1.5 cm*60 cm 玻璃层析柱，天长市吉高实验设备有限公司；FS-450N 探针式超声仪，上海生析超声仪器有限公司。1.2 实验方法 1.2.1 桑葚花青素脂质体的制备 新购经自然风干的黑桑葚干，用高速万能粉碎机打碎或者采用研钵人工碾碎。准确称取质量为 40.00 g的碾碎桑葚置于大烧杯中，按料液比 120(gmL)加入由无水乙醇与 0.1%HCl溶液配制的 75%酸化乙醇溶液，浸泡 12 h。使用超声波清洗仪在功率为 150 w、温度 35 的条件下超声 60 min得桑葚提取液。将桑葚提取液在 4500 r/min转速下离心 10 min，收集上清液，用旋转蒸发仪在 50 下浓缩 2 h，制得花青素粗提取物浓缩液14-15。将AB-8 大孔吸附树脂用蒸馏水冲洗 56 次，至树脂上层蒸馏水澄清。滤去蒸馏水，用 95%乙醇溶液浸泡大孔吸附树脂 24 h，使树脂充分溶胀，且液面需高于树脂层面 23 cm(注意用薄膜封好烧杯口，以防乙醇挥发导致液面下降而无法达到完全浸泡效果)。再将AB-8 大孔吸附树脂湿法填装入清洗干净的玻璃层析柱中，再用 95%乙醇溶液洗脱树脂，洗至流出液与等量水混合后不呈现白色混浊现象；再改用大量蒸馏水洗至无乙醇味且水溶液澄清即可使用。将制备的桑葚花青素粗提取物浓缩液上柱吸附，静置30 min。用2 BV的pH=2水溶液洗脱粗提取物浓缩液中糖类等水溶性杂质。再依次使用20%、40%、60%乙醇洗脱浓缩液中花青