杀线虫苏云金芽胞杆菌NBI...-863高含量悬浮剂的研制_廖先清.pdf

39(1)54-61 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2021-09-23 基金项目：湖北省农业科学院领军人才项目（L2018030）；湖北省农业科技创新中心重大科技研发项目（2020-620-000-002-07）作者简介：*共同第一作者，廖先清，学士，E-mail：；闵勇，博士，E-mail：。*通信作者，刘晓艳，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2021.11.007 杀线虫苏云金芽胞杆菌NBIN-863高含量悬浮剂的研制 廖先清*，闵 勇*，饶 犇，周荣华，陈 伟，刘晓艳*（湖北省农业科学院湖北省生物农药工程研究中心/湖北省农业科技创新中心生物农药分中心/国家生物农药工程技术研究中心，武汉 430064）摘要：目前我国微生物农药原药生产技术已达到甚至超过发达国家水平，但制剂技术却存在较大差距，主要体现在剂型结构不合理、制剂质量差、农药助剂种类及品种少、剂型加工工艺总体水平还比较落后等方面。苏云金芽胞杆菌（Bt）等功能微生物产品的市场容量及应用效果与剂型是密切相关的。为了明确新型生物杀线剂 NBIN-863 的最佳施用剂型，特开展此试验。通过对防腐剂、分散剂、悬浮剂等不同助剂的选择，研制了一种高含量 Bt 悬浮剂（5.21097.9109 CFU/mL）。配方优化试验表明，在 Bt 发酵液中加入0.4%防腐剂山梨酸钾、1.0%分散剂硅酸镁铝、4.0%悬浮剂木质素磺酸钙，用盐酸调节 pH 至 4.5，54 热储前芽胞数最高为 7.9109 CFU/mL，对秀丽隐杆线虫活性最高，LC50为 2.83 mg/L，对黄瓜根结线虫田间防效达 68.64%。综合各指标，尤其是对秀丽隐杆线虫的半致死浓度，杀线虫 NBIN-863 悬浮剂（7.9109 CFU/mL）效果最好，不仅流动性好，而且耐贮藏，是防治作物根结线虫病的理想药剂。关 键 词：苏云金芽胞杆菌；生物杀线剂；高含量悬浮剂 中图分类号：S476.1 文献标志码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0054-08 Development of High Content Suspension of Nematocidal Bacillus thuringiensis NBIN-863 LIAO Xianqing*,MIN Yong*,RAO Ben,ZHOU Ronghua,CHEN Wei,LIU Xiaoyan*(National Biopesticide Engineering Technology Research Center/Biopesticide Branch,Hubei Innovation Centre of Agricultural Science and Technology/Hubei Biopesticide Engineering Research Centre,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)Abstract:At present,the production technology of microbial pesticide technical materials in China has reached or even exceeded the level of developed countries,but there is a large gap in preparation technology,which is mainly reflected in the unreasonable dosage form structure,poor preparation quality,only a few pesticide additives,and the overall low level of dosage form processing technique.The market demand and application benefit of functional microbial products such as Bacillus thuringiensis(Bt)are closely related to the dosage form.This test was initiated to determine the best dosage form of the new biological nematicide NBIN-863.A high content Bt suspension(5.27.9 billion CFU/mL)was developed by selecting different additives,including preservative,dispersant and suspending agent.The dosage form was optimized by adding 0.4%preservative potassium sorbate,1.0%dispersant magnesium aluminum silicate,and 4.0%suspending agent calcium lignosulfonate to the Bt fermentation broth,and by adjusting the pH value to 4.5 using hydrochloric acid,which produced the maximum number of spores 7.9109 CFU/mL before the thermal storage at 54.The dosage form showed the highest activity against Caenorhabditis elegans,with a LC50 value of 2.83 mg/L,and field control efficiency on cucumber root knot nematode of 68.64%.Based on all the indexes,especially the half lethal concentration to Caenorhabditis 第 1 期 廖先清等：杀线虫苏云金芽胞杆菌 NBIN-863 高含量悬浮剂的研制 55 elegans,the nematocidal NBIN-863 suspension(7.9 billion CFU/mL),with good fluidity and long shelf life,is of high potential for controlling crop root knot nematode disease.Key words:Bacillus thuringiensis;bio-nematicide;high content suspension 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）（简称苏云金杆菌，Bt）制剂是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂，它广泛用于防治农业、林业和贮藏物害虫1。由于微生物农药活性成分主要是活体生物，因此制剂加工所采用的助剂种类和剂型与化学农药相比都有特殊性，助剂的选择应以不影响微生物活性为标准，此外微生物只能是均匀悬浮、分散在体系中，而无法像化学农药一样以分子形态溶解在助剂中2。因此制剂剂型是影响微生物农药应用效果的一个重要因素。目前，我国已登记微生物母药产品 62 个，占已登记微生物农药产品总数的 11.3%；在 37 个微生物品种（含亚种）中的 27 个有母药（约占 73%），其余 10 个只有制剂登记2。截至 2021 年 7 月 31 日，苏云金杆菌农药登记共 182 项，主要包括可湿性粉剂、悬浮剂、原药、颗粒剂、油悬浮剂、水分散粒剂、大粒剂及悬浮种衣剂等八种类型，其中以可湿性粉剂登记 89 项排名第一，悬浮剂登记 73 项排名第二，原药/母药登记 11 项排名第三（图 1）3。Bt 剂型产品主要以可湿性粉剂和悬浮剂为主。图 1 截至 2021.7.31 我国苏云金杆菌农药剂型登记情况分析 Fig.1 Analysis on the registration of Bacillus thuringiensis pesticide dosage forms in China as of July 31,2021 迄今为止，国内 Bt 剂型有可湿性粉剂、水悬浮剂、油悬浮剂、水分散粒剂、颗粒剂、油烟雾剂、纳米制剂、生物种衣剂等4，不同剂型适用于不同的植物、不同的用药方式或不同的害虫。水悬浮剂是水基液体农药制剂，一般是将芽胞杆菌原药或发酵液，以水为介质，与分散剂等表面活性剂、黏度调节剂、防冻剂等，进行湿法超微粉碎而制成，外观是黏稠的可流动性液态。悬浮剂有效成分粒子很细，一般粒径为15 m，分散性和展着性都比较好，悬浮率高，粘附于植物表面比较牢固，耐雨水冲刷，药效较高。它兼有乳油和可湿性粉剂的一些特点，没有有机溶剂产生的易燃性和药害问题。悬浮剂可与水任意比例均匀混合分散，使用方便，加工过程未添加有机溶剂，生产过程中基本无三废排放，生产过程简单，不易污染环境，成品率高，安全性高，成为微生物农药的主流剂型5。近年来，水果、蔬菜线虫病害发生逐年加剧，尤其是蔬菜。由于线虫种类相对较多且繁殖速度极快，线虫病初期症状在地下部分，极易被农民忽视，等到发现时症状已经较为严重，防治困难。而传统的粉剂、颗粒剂农药产品施入土壤中后，容易受到土壤团粒结构的吸附等因素的影响而导致药效降低，悬浮剂对于微生物农药产品来说，具有渗透性好、可以最大程度地保留杀虫活性物质、成本低等优势，因此更适合于作物土传性病害尤其是线虫病的防治应用6。56 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 1 材料与方法 1.1 材料 Bt NBIN-863 发酵液，由国家生物农药工程研究中心中试车间生产。防腐剂选用山梨酸钾、对羟基苯甲酸乙酯、苯甲酸钠。分散剂选用木质素磺酸钙、羧甲基纤维素。悬浮剂选用黄原胶、硅酸镁铝。1.2 主要设备 电子天平：PL-601 型，梅特勒-托利多（上海）有限公司。WMS-50 型密闭式砂磨机：筒体容积 50 L，功率 30 KW，主轴转速 918 r/min（秦皇岛欧路化工机械有限公司）。1.3 制备路线 发酵液直接加工工艺。利用 Bt NBIN-863 孢子悬浮液接种，用无菌水刮下茄形瓶孢子菌种，80 水浴 20 min。按发酵罐容积 60%计料投料，灭菌前 pH 7.5。灭菌条件 121，罐压 1 kg/cm2，灭菌时间 30 min。待罐温降至 32 时接种，培养温度 30 32，通气量 1：0.81.0，溶氧大于 20%，罐压控制在 0.5 kg/cm2。定时取样观察菌体生长状态及芽胞晶体形成情况。放罐标准：芽胞脱落 10%20%停止发酵。将发酵液 100 目筛过滤，调 pH 至 4.5，加入一定量的防腐剂、分散剂、悬浮剂，充分混合，砂磨机研磨 1 h，制备成悬浮剂，灌装，检测其流动性、分散性、悬浮率等性状，进行热贮稳定性试验，将样品密封好后放置在（541）的恒温箱中 14 d，检测其对秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans 的杀虫效果。1.4 Bt NBIN-863 悬浮剂助剂的筛选 1.4.1 防腐剂的选择 选择推荐用量的常用食品防腐剂山梨酸钾（国药集团化学试剂有限公司）、对羟基苯甲酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）和苯甲酸钠（国药集团化学试剂有限公司），分别加入 100 mL NBIN-863 发酵液，充分混匀，放置在（351）的恒温箱中，定期观察有无异味。1.4.2 分散剂