三种固定液对两种氧化应激细...C3蛋白免疫荧光染色的影响_宗毓麟.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.01.002三种固定液对两种氧化应激细胞模型 Bclin1 和 LC3 蛋白免疫荧光染色的影响*宗毓麟1于雪1刘畅2刘锦钢1李昱达1汤阳1王淑艳1张淑静1刘燕1（1 北京中医药大学中医学院 北京 102488；2 北京中医药大学生命科学学院 北京 102488）摘要 目的：比较采用三种不同的固定液对两种氧化应激细胞模型 Bclin1 和 LC3 蛋白免疫荧光染色的影响。方法：本研究使用丙酮/甲醇（1:1）固定液、甲醇固定液和 4%多聚甲醛三种固定液分别对氧化应激细胞模型大鼠原代心肌成纤维细胞和 MCF-7 乳腺癌细胞株进行固定，然后再分别进行免疫荧光双染实验，对比三种固定液固定后对自噬关键调控蛋白 Bclin1 和 LC3 染色效果。结果：三种固定液对氧化应激细胞模型 Bclin1 和 LC3 蛋白免疫荧光染色结果存在较大差异。丙酮/甲醇（1:1）固定液固定后免疫荧光染色效果最佳，细胞结构清晰可见，两种蛋白定位表达清晰，甲醇固定液次之，4%多聚甲醛固定液效果欠佳。结论：在对大鼠原代心肌成纤维细胞和 MCF-7 乳腺癌细胞进行自噬相关蛋白免疫荧光双染色实验中，在使用其它固定液染色效果不佳的情况下，可以选择应用丙酮/甲醇（1:1）固定液固定，再进行免疫荧光染色；根据不同实验需求相应选择更适宜的固定液，以达到最佳的荧光染色结果。关键词：固定方法；氧化应激；免疫荧光；乳腺癌细胞；心肌成纤维细胞中图分类号：R-33；Q5-3；Q593文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）01-09-05Effects of Three Kinds of Fixatives on Immunofluorescence Staining ofBclin1 and LC3 Proteins in Two Hypoxic Cell Models*ZONG Yu-lin1,YU Xue1,LIU Chang2,LIU Jin-gang1,LI Yu-da1,TANG Yang1,WANG Shu-yan1,ZHANG Shu-jing1,LIU Yan1(1 College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of traditional Chinese Medicine,Beijing,102488,China;2 College of Life Sciences,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing,102488,China)ABSTRACT Objective:To compare the effects of three different fixation solutions on immunofluorescence staining of Bclin1 andLC3 proteins in two hypoxic cell models.Methods:In this study,primary myocardial fibroblasts and MCF-7 breast cancer cell lines ofhypoxic cell models were fixed with acetone/methanol(1:1),methanol and 4%paraformaldehyde,respectively,and then double im-munofluorescence staining were carried out to compare the staining effects of the three fixatives on the key autophagy regulatory proteinsBclin1 and LC3.Results:There were significant differences in the results of immunofluorescence staining of Bclin1 and LC3 proteins intwo hypoxic cell models with three kinds of fixed solutions.The best effect of immunofluorescence staining was fixed by ace-tone/methanol(1:1).The localization and expression of the two proteins could be seen clearly,while methanol,and 4%paraformalde-hyde appeared poor effect.Conclusions:In the autophagy-associated protein immunofluorescence double staining experiment of cardiacfibroblasts and MCF-7 breast cancer cells,when other fixatives are used and the staining effect is worse,acetone/methanol(1:1)fixationsolution is a good choice before immunofluorescence staining.Moreover,choosing a more suitable fixation solution according to differ-ent experimental requirements could help to achieve the best fluorescence staining results.Key words:Fixation;Oxidative stress;Immunofluorescence;Breast cancer cells;Cardiac fibroblastsChinese Library Classification(CLC):R-33;Q5-3;Q593Document code:AArticle ID:1673-6273(2023)01-09-05*基金项目：国家自然科学基金项目（82004337）；中央高校基本科研业务费自主选题（2021-SYJS-002；2019-XJ-SYJJ-010）作者简介：宗毓麟（1996-），男，硕士研究生，主要研究方向：辨证论治规律研究，E-mail:通讯作者:张淑静（1984-），女，博士，高级实验师，主要研究方向：中医药基础实验研究，E-mail:；刘燕（1974-），女，硕士，高级实验师，主要研究方向：神经精神疾病病证结合研究，E-mail:（收稿日期：2022-03-25 接受日期：2022-04-20）前言免疫组织化学的原理是抗原抗体反应和组织化学呈色反应，在抗体特异性显色后，对其进行定性、定位和半定量测定。免疫荧光染色法是常用的免疫组织化学方法之一，原理是以荧光物质标记抗体而进行抗原定位，具有特异性强、敏感性高、检测速度快等优点，因而被广泛应用于病理学等研究中。恰当的组织处理是做好免疫荧光的重要前提1，其中，组织的固定是决定染色成功与否的关键所在，选用合适的固定液直接关系到染色的效果。例如，林国豪等2研究发现，6 种不同固定液均可使融合了 RFP 和 GFP 基因的鼻咽癌细胞内的荧光蛋白淬灭，且对核蛋白及胞浆蛋白影响不同。氧化应激是指细胞受活性氧化9现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.1JAN.2023物攻击而引起细胞损伤，在临床报道中与多种疾病发病机制密切相关，建立可靠的氧化应激模型，对于揭示氧化应激机制具有重要意义3。本文探究了三种不同固定液对心肌成纤维细胞和 MCF-7 乳腺癌细胞株为基础的氧化应激模型 Beclin1（自噬效应蛋白）和 LC3（微管相关蛋白 1A/1B-轻链 3）免疫荧光染色的影响，以期为氧化应激细胞模型 Bclin1 和 LC3 蛋白免疫荧光染色中固定液的选择提供依据。1 材料与方法1.1 材料与仪器胎牛血清（翱擎）、胶原酶 II（Gene-bio）、0.25%胰蛋白酶消化液（含 EDTA，翱擎）、DMEM 培养基（Invitrogen）、RPMI1640培养基（Hyclone）、DMSO（Sigma）、自噬相关蛋白 LC3 抗体（Proteintech,14600-1-AP）和Beclin1抗 体（Proteintech,66665-1-Ig）、荧光二抗（Proteintech,SA00013-1、SA00013-4），含DAPI 封片剂（北京索莱宝），甲醇（国药），丙酮（国药），4%多聚甲醛（索莱宝），其他细胞培养相关试剂与耗材均购于北京索莱宝公司；乳腺癌细胞系 MCF-7 购于国家实验细胞资源共享平台（北京总部），乳鼠（SD，北京维通利华实验动物技术有限公司）；三气培养箱（Thermo，160i），Revolve FL 型正倒置一体荧光显微镜(Echo)。1.2 方法1.2.1 心肌成纤维细胞的原代培养及氧化应激细胞模型的制备采用出生 7 天的乳鼠，取出其心脏，放入提前准备好的灭菌处理烧杯中，烧杯中已提前倒入 95%乙醇，将大鼠浸入，几秒钟后用镊子夹出。剪开胸部皮肤，暴露出胸腔，剪取心脏，将心脏放入冰冷的 PBS 中（4），剪除心脏周围血管等其它组织，并洗去表面残留的红细胞，将大鼠心脏置于高温高压灭菌后的玻璃皿中，PBS 漂洗三次，置入另一事先准备好的小型培养皿中，将糊状的心肌组织和 3 mL 的 II 型胶原酶（浓度为 1 mg/mL）混悬液吸入 15 mL 的离心管中，放入 37震荡 CO2培养箱中消化5 min，取出后静置于试管架上，待混悬液分层后，用吸管轻轻吸取上清液，勿用力吸取以免吸入沉淀，吸取后置于离心管中。加入 2 mL II 型胶原酶于沉淀中，放入 37震荡 CO2培养箱中消化 5 min，静置 2 min，吸取上清液，重复上述步骤共 4 次，直到细胞彻底消化完成。将每次吸入离心管中的上清液离心后接种细胞于 20%的胎牛血清的 DMEM 培养基中，3 h 后弃掉培养基，加入新鲜的培养基，传代培养第 2 代和第 3 代时候，将细胞按照 1105个/mL，接种于 24 孔板中，根据实验室经验，选择过氧化氢的最佳作用浓度为 100 mol/L 作用 2 h，诱导心肌成纤维细胞氧化应激细胞模型，进行后续的免疫荧光实验等检测。1.2.2 MCF-7 乳腺癌细胞株的培养及氧化应激细胞模型的制备取出-80冰箱中的 MCF-7 细胞株进行复苏，之后使用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基，当传代至 2-3 代时，观察到细胞的培养状态良好，将细胞按照 1105个/mL，接种于 24 孔板中，根据实验室经验，选择过氧化氢的最佳作用浓度为 100mol/L作用 2 h，诱导乳腺癌细胞株细胞氧化应激细胞模型，即进行免疫荧光实验。1.2.3 细胞固定（1）弃除培养基，用复温的 PBS 轻柔冲洗 3次。（2）细胞固定：分别用丙酮/甲醇(1:1）固定液、甲醇固定液和 4%多聚甲醛固定液固定细胞，将细胞完全覆盖为准，常温固定 20 min。除去固定液，PBS 洗 3 次，每次 5 min。（3）透化：将0.2%Triton X-100 用 PBS 稀释为浓度 0.1%的溶液，覆盖细胞表面室温 10 min，然后 PBS 洗 5 min3 次。（4）封闭：加入 5%BSA-PBS 使样品完全浸没，37封闭 60 min，封闭时可