荣筋拈痛方调控LncRNA...骨关节炎软骨退变的作用机制_戴雨婷.pdf

博硕园地 福建中医药 2023 年 1 月 第 54 卷 第 1 期Fujian Journal of TCM January 2023，54（1）荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎软骨退变的作用机制戴雨婷1，郑若曦1，王鹤2，陈俊2，陈振沅1，吴广文3*（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；3.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122）摘要：目的 探究荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎（KOA）软骨退变的作用机制。方法 将46只8周龄雄性SD大鼠随机分为空白组（13只）与造模组（33只）。采用改良Hulth法复制大鼠KOA模型，造模2周后，随机选择2组中各3只大鼠拍摄膝关节MRI，鉴定造模是否成功。造模成功后，将30只造模组大鼠随机分为模型组、治疗组和对照组，每组各10只。各组予相应药液灌胃12周后，切取右侧胫骨平台软骨组织，采用Real-time PCR法检测软骨组织中LncRNA H19、miR-675、型胶原（Collagen）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因水平。结果 与空白组比较，模型组软骨组织LncRNA H19、miR-675、Collagen、Aggrecan基因水平均明显降低（P0.05）；与模型组比较，治疗组与对照组中LncRNA H19、miR-675、Collagen、Aggrecan基因水平水平均明显升高（P0.05）。结论 荣筋拈痛方可能通过上调 LncRNA H19/miR-675 促进 Collagen、Aggrecan表达，从而延缓大鼠软骨退变，起到治疗KOA的作用。关键词：膝骨关节炎；荣筋拈痛方；软骨退变；LncRNA；miRNA；大鼠骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的退行性疾病，膝关节因其承载全身负重而最为多发1-2。膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的形成与人口老龄化、肥胖、不良生活习惯、错误运动方式、职业、外伤史、家族史等因素密切相关，在女性中更为多见，且发病群体出现年轻化趋势3。以软骨基质进行性丢失为典型表现的软骨退变是 KOA发病的关键，软骨基质主要由以型胶原（Collagen）为主的各种胶原蛋白和以聚集蛋白聚糖（Aggrecan）为主的蛋白多糖构成4-5，因此有效调控Collagen与Aggrecan的合成和分解代谢是延缓软骨退变的关键。研究发现长链非编码 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）不但调控癌症等疾病的发生，而且在 OA 相关细胞中的表达存在差异性，对延缓KOA发病具有重要调节作用6-7；微小RNA（micro RNA，miRNA）可通过调控胶原蛋白表达影响软骨细胞的衰老与修复，这被认为是有效治疗OA 的新工具8-9。研究表明，LncRNA H19 通过调控 miR-675 可促进参与合成软骨细胞相关蛋白的分泌，从而减缓 KOA 进程10。荣筋拈痛方是挖掘陈可冀院士 清宫配方集成 基础上拟定而成，前期研究发现荣筋拈痛方可通过多靶点、多途径对KOA大鼠起到一定的治疗作用11，但其是否可通过调控 LncRNA H19/miR-675 治疗 KOA 尚不明确。本研究构建KOA模型，通过观察荣筋拈痛方对软骨组织中 LncRNA H19/miR-675 及下游 Collagen、Aggrecan表达水平的影响，旨在探讨荣筋拈痛方延缓大鼠 KOA 软骨退变的作用机制，为其临床应用提供实验依据。1实验材料1.1实验动物SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 46 只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2007-0011。1.2实验药物荣筋拈痛方颗粒剂由江阴天江药业有限公司生产（批号：2006001）；盐酸氨基葡萄糖胶囊由香港澳美制药公司生产（批号：4170135）。参照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”12计算，大鼠给药量是成人的6倍。按照大鼠灌胃量为10 mL/kg，将1袋荣筋拈痛方颗粒剂溶解于0.9%生理盐水后定容至100 mL；将1粒盐酸氨基葡萄糖胶囊溶解于0.9%生理盐水后定容至100 mL。1.3实验试剂Trizol（美国 Thermo Fisher 公司）；无水乙醇（美国 Sigma 公司）；氯仿（西陇科学股份有限公司）；异丙醇（中国国药集团化学试剂公司）；Mir-XTM miRNA 逆 转 录 试 剂 盒、PrimeScriptTM RT mRNA 逆转录试剂盒、TB GreenTM Premix ExTaqTM试剂盒（日本 Takara 公司）；AceQqPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。1.4实验仪器全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国收稿日期：2022-08-22基金项目：国家自然科学基金项目（82074465）；福建省自然科学基金面上项目（2020J01750）通信作者：吴广文，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0101137福建中医药第 54 卷Thermo 公司）；PCR 仪（美国 Bio-Rad 公司）；7500 Fast实时荧光定量基因扩增仪（美国ABI公司）。2方法2.1分组与造模46 只 SD 大鼠适用性喂养 1 周后，随机分为空白组（13 只）与造模组（33 只）。空白组进行假手术处理，将膝关节内侧切开 1 cm 左右的皮肤与肌肉后随即缝合，不打开关节腔；造模组采用改良 Hulth 法构建大鼠 KOA 模型13，同时连续 3 d 肌内注射 20 万 U 青霉素防止感染。造模2周后，随机选择2组中各3只大鼠拍摄膝关节MRI，鉴定造模是否成功。造模成功后，随机将造模组大鼠分为模型组、治疗组和对照组，每组各10只。2.2药物干预治疗组按 1.9 g/（kg d）予荣筋拈痛方颗粒药液灌胃，对照组按0.15 g/（kg d）予盐酸氨基葡萄糖胶囊药液灌胃，空白组与模型组予等量0.9%生理盐水灌胃。每日灌胃2次，连续灌胃12周，每周称取1次体质量调整灌胃量。2.3取材连续干预12周后，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，打开膝关节腔，剥离膝关节周围的肌肉、韧带等组织，分离右侧胫骨平台后迅速投入液氮中，随后放入-80 冰箱保存。2.4Real-time PCR法检测LncRNA H19、miR-675、Collagen、Aggrecan基因表达水平2.4.1总 RNA 提取将各组右侧胫骨平台样本从-80 冰箱取出，收集软骨组织并加入液氮研磨，采用 Trizol试剂盒提取各组总 RNA，并于分光光度计检测总RNA浓度。2.4.2miRNA 的逆转录与检测配置 miRNA 逆转录体系 10 L：mRQ Enzyme Mix 1.25 L，mRQ Buffer（2）5 L，1 g 总 RNA 与 DEPC 水共 3.75 L。反应条件：37 1 h，85 5 min，4 保存。以逆转录成的 cDNA 为模板，配置 Real-time PCR 反应体系。U6 反应体系：Mix（2）5 L，ROX（50）0.2 L，U6-F 0.4 L，U6-R 0.4 L，cDNA 2 L，DEPC水2 L。miR-675反应体系：Mix（2）5 L，ROX（50）0.2 L，miR-675 引物 0.4 L，mRQ3 Primer 0.4 L，cDNA 2 L，DEPC 水 2 L。扩增反应条件：95 预变性30 s，95 变性10 s，60 退火34 s，共40个循环，最后95 15 s，60 延伸1 min。以 U6 为内参，采用 2-Ct法分析 miR-675 相对表达水平，引物序列见表1。2.4.3LncRNA/mRNA的逆转录与检测配置mRNA逆转录体系20 L。gDNA去除：gDNA Eraser 1 L，gDNA Eraser Buffer（5）2 L，1 g总RNA与DEPC水共 7 L，离心后室温静置 5 min。Prime Script RT Enzyme Mix1 L，Prime Script Buffer（5）4 L，RT Primer Mix 1 L，DEPC水4 L。反应条件：37 15 min，85 5 s，4 保存。以逆转录成的cDNA为模板，配置Real-time PCR反应体系：Mix（2）10 L，ROX（50）0.4 L，各指标正向引物（F）与反向引物（R）各 0.4 L，cDNA 1 L，DEPC 水 7.8 L。扩增反应条件为：95 预变性10 min，95 变性10 s，60 退火 34 s，共 40 个循环，最后 95 15 s，60 延伸 1 min。以-actin 为内参，采用 2-Ct法分析LncRNA H19、Collagen、Aggrecan基因相对表达水平。引物序列见表1。2.5统计学方法运用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料符合正态分布采用（x s）表示。当满足正态分布时，运用单因素方差分析，若方差齐则运用LSD-t检验进行组间两两比较，若方差不齐则运用 Games-Howell 检验进行组间两两比较。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1实验动物饲养情况治疗组有 2 只大鼠在灌胃过程中可能因肺栓塞死亡。3.2膝关节MRI结果空白组大鼠膝关节整体结构完整且无肿胀，内外侧半月板形态完好，关节腔间隙正常无积液，胫骨平台与股骨髁软骨的表面平整。造模组大鼠膝关节整体结构不完整，肿胀明显，内侧半月板缺失，关节腔间隙变宽且有积液累积，胫骨平台与股骨髁软骨的表面不平整，局部缺如，伴有结缔组织增生与骨赘形成，以上结果表明大鼠KOA模型建立成功。见图1。表1PCR 相关扩增引物序列基因miR-675-3pU6LncRNA H19CollagenAggrecan-actin正向引物（F）GCCTGTATGCCCTAACCGCTCTCGCTTCGGCAGCACAGCACTCAGAACCACTACACTACACACCGCTAACGTCCAGATGGGAGCAGCAGTCACATCTTCACCCACACTGTGCCCATCTATGA反向引物（R）AACGCTTCACGAATTTGCGCTTGGCTCCAGGATGATGTGGTACGTGAACCTGCTGTTGCCATCAGACCAGCGGAAGTCATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG38戴雨婷 等：荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎软骨退变的作用机制第 1 期3.34 组大鼠软骨组织 LncRNA H19、miR-675、Collagen和 Aggrecan基因表达水平比较与空白组比较，模型组软骨组织 LncRNA H19、miR-675、Collagen和 Aggrecan 基因水平均明显降低（P0.05）；与模型组比较，治疗组和对照组软骨组织LncRNA H19、miR-675、Collagen和 Aggrecan 基因水平均明显升高（P0.05）。见图2。4讨论KOA 临床常表现为疼痛、肿胀、僵硬、关节屈伸不利、活动受限等，严重者会致畸、致残，给患者和社会带来严重的经济损失与生活负担14。流行病学调查数据发现，40、60、80 岁以上人群患病率分别为 38、50、8015-16。局部使用非甾体类抗炎药为目前 KOA 的一线治疗方法。与口服相比，关节腔内注射配合糖皮质激素治疗是临床常用的选择，疗效显著且副作用小17。但是非甾体类抗炎药的广泛使用存在患有心肌梗死的弊端，除此之外还存在胃肠道出血的毒副作用，具有一定程度的死亡率，严重危害患者的生命安全。手术治疗因其较高的手术置换费用、术后并发症、康复时间长等缺点不被晚期患