缺氧肾小管上皮细胞Rab7...MP-2轴失调促进肾纤维化_程正源.pdf

东南大学学报(医学版)J Southeast Univ(Med Sci Edi)2023，Feb;42(1):57-64收稿日期2022-10-10 修回日期2022-11-10基金项目江苏省自然科学基金资助项目(BK20200272);安徽医科大学校基金资助项目(2022xkj129)作者简介程正源(1987 )，男，安徽马鞍山人，主治医师，医学博士。E-mail:czy230159257163 com通信作者陈平圣E-mail:101006254 seu edu cn引文格式程正源，张晓娟，方桂琳，等 缺氧肾小管上皮细胞 ab7/Caveolin-1/MMP-2 轴失调促进肾纤维化J 东南大学学报(医学版)，2023，42(1):57-64 论著 缺氧肾小管上皮细胞 ab7/Caveolin-1/MMP-2 轴失调促进肾纤维化程正源1，张晓娟2，方桂琳2，许卿3，杨一琼3，陈平圣3(1 东南大学医学院附属马鞍山市人民医院 内科，安徽 马鞍山243099;2 东部战区总医院 肾内科，江苏 南京210016;3 东南大学医学院 病理学系，江苏 南京210009)摘要目的:研究肾纤维化晚期 as 相关 GTP 结合蛋白 7(as-related GTP binding protein 7，ab7)可否通过小窝蛋白-1(Caveolin-1)的介导调节基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的活性，从而对肾纤维化产生影响。方法:通过单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)法构建 C57BL/6 小鼠肾纤维化模型，检测肾纤维化组织中缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、ab7 和 Caveo-lin-1 的表达以及 MMP-2 的活性。利用肾小管上皮细胞株(HK-2)进行体外实验，构建 HK-2 ab7-shNA 细胞，将 HK-2 和 HK-2 ab7-shNA 细胞分别进行常氧和缺氧培养，并检测各组中 HIF-1、ab7、Caveolin-1 的表达和 MMP-2 的活性，以及纤维化相关指标 I 型胶原(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)和-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin，-SMA)的表达。结果:利用小鼠 UUO 模型发现，相较正常肾脏组织，肾纤维化组织中 ab7 和 Caveolin-1 的表达均上调，而 MMP-2 的活性反而下降。进一步体外实验显示，在 HK-2 细胞中ab7 下调后可通过抑制 Caveolin-1 的表达进而提高 MMP-2 的活性，并会使 Collagen-1、Vimentin 和-SMA等反映纤维化的指标表达下调。结论:ab7 与 MMP-2 的活性密切相关;ab7 对 MMP-2 活性的调节通过Caveolin-1 介导;当 ab7 表达受抑后，可促进肾纤维化的缓解。关键词as 相关 GTP 结合蛋白 7;小窝蛋白-1;基质金属蛋白酶-2;肾纤维化;小鼠 中图分类号692 9 文献标志码A 文章编号1671-6264(2023)01-0057-08doi:10 3969/j issn 1671-6264 2023 01 008Dysregulation of the ab7/Caveolin-1/MMP-2 axis in hypoxic tubularepithelial cells promotes renal fibrosisCHENG Zhengyuan1，ZHANG Xiaojuan2，FANG Guilin2，XU Qing3，YANG Yiqiong3，CHEN Pingsheng3(1 Department of Internal Medicine，Maanshan People s Hospital Affiliated to School of Medicine，Southeast University，Maanshan 243099，China;2 Department of Nephrology，General Hospital of Eastern Theater Command，Nanjing 210016，China;3 Department of Pathology，School of Medicine，Southeast University，Nanjing 210009，China)75 AbstractObjective:To study whether as-related GTP binding protein 7(ab7)can regulate the activity ofmatrix metalloproteinase-2(MMP-2)through the mediation of Caveolin-1 in the advanced stage of renal fibrosis，thereby affecting renal fibrosis Methods:The renal fibrosis model of C57BL/6 mice was established by unilateralureteral obstruction(UUO)method，and the expressions of hypoxia inducible factor-1(HIF-1)，ab7，Caveo-lin-1 and the activity of MMP-2 were detected in renal fibrosis tissues The renal tubular epithelial cell line(HK-2)was used for in vitro experiments First，HK-2 ab7-shNA cells were constructed HK-2 and HK-2 ab7-shNAcells were cultured in normoxia and hypoxia respectively，and HIF-1，ab7，Caveolin-1 expression and MMP-2activity were detected in each group Then the expression of fibrosis related indicators，such as Collagen-1，Vimen-tin and-smooth muscle actin(-SMA)were also detected esults:Using the mouse UUO model，it was foundthat the expression of ab7 and Caveolin-1 were both upregulated in renal fibrosis tissues compared with normalkidney tissues，while the activity of MMP-2 was decreased Further in vitro experiments revealed that ab7 down-regulation in HK-2 cells could increase the activity of MMP-2 in HK-2 supernatant by inhibiting Caveolin-1 expres-sion，and down-regulate the expression of Collagen-1，Vimentin and-SMA Conclusion:ab7 is closely relatedto MMP-2 activity，and the regulation of MMP-2 activity by ab7 is mediated by Caveolin-1 When the expressionof ab7 is inhibited，it can promote the remission of renal fibrosis Key wordsas-related GTP binding protein 7;Caveolin-1;matrix metalloproteinase-2;renal fibrosis;mice慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)严重威胁人类健康1。随着 CKD 的进展，肾功能会逐渐丧失，最后演变为终末期肾脏病(end stage renal disease，ESD)，肾间质的纤维化为此时肾脏组织的主要病理变化，而肾间质纤维化一旦形成，则难以逆转，因此肾间质纤维化是所有 CKD 的最终结局2-3。缺氧可导致肾细胞损伤4，而肾间质纤维化的形成与肾组织中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)不断沉积，肾组织内氧弥散障碍，从而使肾组织的缺氧程度不断加重有关5。Fine 等6 因此提出了“慢性缺氧理论”，认为慢性缺氧是促使肾纤维化加重的重要原因之一，目前得到广泛认可。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)对肾间质纤维化的发展至关重要。在纤维化早期，MMP-2 活性增加7，可通过破坏肾小球基底膜等促进 ECM 的沉积，推动疾病的发展;而在纤维化晚期 MMP-2 活性反而降低5，导致 ECM 降解减少，最终使 ECM 在肾间质中大量积累，使纤维化难以缓解。而晚期 MMP-2 活性下降的原因至今不清，但可能与缺氧导致的细胞内吞有关8。MMP-2 的活化主要在细胞膜表面进行，因此细胞膜的结构变化对 MMP-2 活性的改变存在影响。内吞是细胞基本功能之一，内吞过程伴有胞膜重塑，缺氧时细胞内吞活跃9，因此在肾纤维化晚期，如能抑制内吞，可能使 MMP-2 活性增高，而促进肾纤维化的缓解。小窝蛋白-1(Caveolin-1)对内吞活动有重要作用10，抑制 Caveolin-1 后可以提高 MMP-2 的活性11，但具体原因不清。as 相关 GTP 结合蛋白 7(as-re-lated GTP binding protein 7，ab7)是调节细胞自噬活动的重要分子12-13，抑制 ab7 后可通过抑制细胞自噬而使 MMP-2 的活性上调14。ab7 对细胞内吞活动也有枢纽作用12-13，而 ab7 与内吞和 MMP-2 的活性三者间关系的研究报道较少。故若抑制 ab7 后，是否可以通过抑制 Caveolin-1 而使 MMP-2 的活性上调，从而缓解肾纤维化，这值得思考。本研究对此进行了相关实验，旨在为肾纤维化的治疗提供新思路。1材料和方法1 1单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruc-tion，UUO)法小鼠肾纤维化模型的建立C57BL/6 小鼠(南京麦杰斯公司)，8 周龄，体质量25 28 g，15 只。以4%水合氯醛 0 2 ml(20 g)1腹腔注射麻醉后，将小鼠固定于手术台上，剪毛消毒后行背部近脊柱切口，暴露并分离一侧输尿管，用 4-0 线于近肾下极处结扎一道，另于远侧再结扎一道后缝合。15只 C57BL/6 小鼠不处理，作为空白对照。14 d 后处死小鼠，取肾脏组织进一步检测。本实验经东部战区总医院实验动物伦理委员会批准(2020GLHGKJDWLS-135)。1 2组织病理学和免疫组化检测处死小鼠后立即取出肾脏组织，用 10%福尔马林固定 24 h 后低温石蜡包埋，并将石蜡块切成 3 m 厚85东南大学学报(医学版)2023 年 2 月，42(1)的切片。之后用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和 Masson 染色分别显示小鼠肾脏组织变化。用-SMA 抗体对切片进行免疫染色。先将