日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析_杨卓雄.pdf

第 卷第期 草地学报 年 月 ：日本结缕草 基因生物信息学及表达模式分析杨卓雄，董笛，韩烈保，晁跃辉（北京林业大学，北京 ）摘要：是高等植物所特有的一类转录因子，参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草（）中克隆出 基因，并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。基因完整编码区为 ，编码 个氨基酸。蛋白无信号肽，具有疏水性，系统发育进化树结果显示其与玉米（）亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。基因表达模式结果显示，该基因在幼嫩叶片中大量表达，随植物发育表达量逐渐减少，但茉莉酸甲酯（）等个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示 具备自激活活性。本研究为进一步研究 基因提供了科学依据。关键词：日本结缕草；基因；生物信息学；表达模式分析中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，.，（），（）（）：；收稿日期：；修回日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）资助作者简介：杨卓雄（），女，汉族，宁夏石嘴山人，硕士研究生，主要从事草坪草分子生物技术研究，：；通信作者 ，：，转录因子是高等植物所特有的转录因子小家 族，由 三 个 特 征 成 员 玉 米 的 （）、金鱼草（）的 （）以及水稻（）的 （）命名。结构域包含一个非典型的碱性螺旋环螺旋（）结构域，涉及 结合、蛋白质蛋白质相互作用和蛋白质核定位。基于氨基酸序列的差异，特别是在 结构域的基本区域，转录因子家族可进一步分为类和类两个亚家族，类的 也称作 类，以水稻中的 与 为代表，类的 也称作 类，以金鱼草中的 和玉米中的 为代表。与 的成员相比，类成员在 结构域多有四个氨基酸残基，例如谷氨酸半胱氨酸谷氨酸（）延伸，一些类蛋白质包含草地学报第 卷一个由极性氨基酸组成的保守 结构域，通过形成亲水螺旋介导蛋白质相互作用，。类成员可以根据 结构域中的序列差异进一步细分为 和 两 个 分 支，子 代 以 （）为 代 表，而 子 代 以 为 代表。转录因子在植物发育过程中起着至关重要的作用。研究表明 类中的 和 两个分支主要参与植物发育，但 类的基因的作用则与之相反，在调控叶片发育过程中最为明显，类 基因抑制 细胞 增 殖，而类 则是正 向调控。此外，在类 转录因子成员中，拟南芥（）的 和 分别参与了叶片和花发育过程中细胞增殖的激活和抑制。通过与启动子相互作用，调控的转录，进一步调控植物的生长发育。拟南芥 过表达株系显示出晚花表型和叶片形态改变，表明 参与了对开花时间和发育的调控。在类 转录因子成员中，基因参与了侧向器官的发育及调控细胞分裂素和生长素信号转导，基因与植物开花有关。根据系统发育分析，将 基因进一步分为三类（，和 ）。基因在控制腋芽分化和分枝中起着重要作用，基因在控制花的正向和背面对称性中起着重要作用，而 在花原基和侧枝中均有表达，但对花分枝的控制不大，。是类 转录因子中的成员，属于古老植物特有的基因家族，可调控植物芽、花和胚的发育。在拟南芥中，可以促进生长素的合成，对茉莉酸的代谢起负调控作用 。有研究显示，可介导拟南芥根部的硝酸盐吸收的系统信号通路，突变体在根生长方面有缺陷，但在根的硝酸盐吸收反应中没有缺陷。日本结缕草（）是禾本科（）结缕草属（）多年生草本，主要用于运动场地草坪。属于暖季型草坪草喜温暖湿润气候，喜光，且有一定的耐阴性，抗旱、抗盐碱、耐瘠薄、耐践踏 。基因家族广泛存在与高等植物中，但关于 基因的研究鲜有报道，因此本研究通过对日本结缕草 基因的克隆及生物信息学分析来为 转录因子提供科学依据，也有助于后续研究日本结缕草的生长发育奠定基础。材料与方法 试验材料及试剂试验采用的日本结缕草种由北京林业大学草坪分子实验室提供，放置人工气候箱内培养，昼夜相对时长为 ，温度为，湿度为。克隆载体 、连接酶、反转录 试剂盒、限制性核酸酶 和 、酵母转化试剂盒和荧光定量试剂 购 买于 公司。提取试剂 盒 、纯化试剂盒 、细胞质粒提取试剂盒 等购买于 公司。大肠杆菌 感受态细胞购买于博雅宏兴，酵母菌株 、酵母阳性对照质粒 、阴性对照 空载、农杆菌 、植物表达载体 等，均来自北京林业大学草坪分子实验室。脱落酸等植物激素购自 公司。其它应用的试剂均为国内分析纯。试验方法 引 物 设 计引 物 设 计 应 用 软 件 。基于已知的日本结缕草参考基因组序列及本实验室测定的转录组信息设计特异性引物 和 扩增 基因以所获得的 全长序列。并且以 载体的序列为基础，设计 载体连接引物 和 。设 计 引 物 及 用于 的载体构建。日本结缕草 基因作为内参，内参引物分别为 以及 ，和 以 基 因 序 列 为 基础，作为荧光定量检测的特异性引物（表）。表本试验所用引物序列 引物 序列（）（）第期杨卓雄等：日本结缕草 基因生物信息学及表达模式分析 基因克隆日本结缕草经个月生长成熟后，剪 取 叶片 将其 研 磨，按 照试 剂 盒 说明提 取总 并进行反转录得到 。利用 和 对 进 行 扩 增，反 应 程 序 为 ；，（），个循环；，保温。凝胶电泳检测后，将其与 载相连，转入大肠杆菌 ，挑取在 抗性 培养基上大肠杆菌单菌落，进行检测，选择符合长度要求的菌落送至生物公司测序，选择测序正确的菌落进行保菌和质粒提取。生物信息学分析使用 网站（：）对蛋白质长度、等电点、分子量、疏水性等性质进行分析。利用 （：？）工具预测蛋白质三级结构。根据 网站（：）预测信号肽。通过 数据库（：）查找 同源蛋白。利用网站（：）以 及 、软件进行保守结构域以及系统发育进化树分析 。载体构建及亚细胞定位利 用 特 异 性 引 物 和 扩增模板 ，并且使用限制性内切酶 酶切 载体，利用无缝链接酶连接 产物和 载体，转化大肠杆菌。对构建成功的载体，将其质粒转化农杆菌感受态 ，注射本生烟草叶片，然后将烟草置于黑暗环境下培养，共聚焦显微镜下观察 信号在细胞中的分布情况。载体的构建及 酵母的转化利用引物 和 ，扩增 模板，并用限制性内切酶 酶切载体，纯化后，将切好的载体与 产物连接，构建 载体，转入大肠杆菌感受态 中。使用 载体的通用引物 和 对单菌落进行验证，选择长度接近的单菌落送至生物公司测序。大量提取测序准确的载体质粒，并将其阳性对照 质粒和阴性对照 空载按照酵母转化试剂盒要求一起转到大肠杆菌 菌株中。转录自激活试验将转化的 的 酵母菌株涂于 平板上，比较 和 在培养基上菌落呈现的状态。然后将转化 载体成功的 酵母涂于 、培 养 基 上，在 下 孵 育。观 察 酵母菌株的生长状态和菌株颜色进行记录及统计。实时荧光定量 采集植物幼嫩叶片，成熟叶片和衰老叶片以及成熟的茎和根。对成熟叶片分别喷施 浓度的赤霉素及 浓度的水杨酸，取个时间点，和 的叶片样品。将上述所有样品立即液氮速冻，并研磨提取总，反转录得到 。内参引物 为 和 ，设计特 殊引物 和 按照试剂盒要求进行实时荧光定量。数据分析利用 进行显著性分析（），利用 绘图。结果与分析 日本结缕草 基因的克隆利用设 计 好 的 引 物 和 对 进行扩增，扩增出一条长 的单一条带，编码 个氨基酸（图）。将其与 载相连，转入大肠杆菌 ，挑取在大肠杆菌单菌落，选 择 符 合 长 度 要 求 的 质 粒 命 名 为 。草地学报第 卷图日本结缕草 基因的克隆 注：，基因的 鉴定；，基因的 序列及蛋白质序列 ：，；，日本结缕草 蛋白质结构分析 分子式为 ，由 个氨基酸组成，分子量为 ，理论等电点为 。在蛋白二级结构组件中，随机线圈占比高达，螺旋占比为，链的含量占比最少，为（图）。蛋白质三级结构结果预测 蛋白由螺旋和环构成（图）。利用 网站预测 蛋白质，结果显示无信号肽（图）。蛋白质的疏水性图谱如图 所示，数值大于表示疏水性，小于则表示亲水性。总平均亲 水性 为 ，则 可能 为亲水蛋白。图日本结缕草 蛋白结构预测 注：，蛋白的二级结构预测；，蛋白的三级结构预测；，信号肽预测；，蛋白疏水性图谱 ：，；，；，；，日本结缕草蛋白进化树及保守结构域分析 及 对 同源蛋白进行比对并绘制系统发育进化树，结果显示日本结缕草中的 蛋白与玉米中 最相似（图第期杨卓雄等：日本结缕草 基因生物信息学及表达模式分析）。蛋白的保守结构域分析显示 蛋白内有三段最为保守的结构域，蛋白与 蛋白等其他 蛋白相比缺少了一段蛋白结构域（图）。图日本结缕草 蛋白的遗传进化树分析 注：表示 月季（），表示 二球悬铃木（），表 示 麻 风 树（），表 示 杭 白 菊（），表示 铁皮石斛（），表示 玉米（），表示 拟南芥（），表示 芜菁（.）：，.图 蛋白的保守结构域分析 日本结缕草 亚细胞定位分析为研究 在 细 胞 中 的 定 位 情 况，将构 建 完 整 的 载 体 转 化 农杆菌，注射本生烟草叶片，结果显示 蛋白 定 位 在 叶 绿 体、细 胞 质 和 细 胞 核上（图）。草地学报第 卷图日本结缕草 亚细胞定位情况 注：，融合场；，叶绿体自发荧光；，激发光 ：，；，；，酵母自激活检测转入 载体、阳性对照 载体和阴性对照 空载的 酵母在 的培养基内生长正常，且 和阳性对照在 培养基和 培养基内可以正常生长，形成蓝色菌斑（图，），空载不能形成蓝色菌斑（图），证实 具备自激活活性。图酵母转录自激活检测 注：，的酵母自激活检测；，阳性对照 载体的酵母自激活检测；，阴性对照 载体的酵母自激活检测 ：；：；：日本结缕草 基因表达模式分析通过 试验研究日本结缕草 基因在不同组织器官、叶片不同发育时期及不同激素处理的表达模式。结果表明，该基因在叶片中大量表达，且与根和茎的表达量有显著差异（图）。在叶片不同发育时期下，基因在幼嫩叶片中大量表达，随植物生长基因表达量不断下降（图）。经脱落酸（）处理后，基因的表达没有显著差异（图），这表明 基因很可能不受 激素的诱导。经水杨酸（）处理后，表达量在喷施后显著下降，但总体没有显著差异（图）。经茉莉酸甲酯（）处理后，表达量在没有显著差异，但在迅速升高，总体没有显著差异（图）。第期杨卓雄等：日本结缕草 基因生物信息学及表达模式分析图日本结缕草中的 的表达模式 讨论转录因子参与特定生理或生化过程的调控，在调控植物非生物逆境胁迫方面发挥重要作用。是植物所特有的一类转录因子，在诸多植物中被鉴定出来，参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程 。根据氨基酸序列的差异，转录因子可被分为 和 两个亚家族，属于类 转录因子中的成员。本研究对日本结缕草 基因进行克隆、生物信息学分析、自激活检测及表达分析来探究 基因的特性。从日本结缕草中克隆得到 完整编码区有 ，编码 个氨基酸。蛋白分子量为 ，具有疏水性，但不具信号肽。构建系统发育进化树有利于研究生物的进化关系，对 同源蛋白进行比对，绘制系统发育进化树显示日本结缕草中的 蛋白与玉米中 亲缘关系最近。亚细胞定位显示 定位在叶绿体、细胞质和细胞核内。酵母双杂交系统主要应用于快速验证蛋白之间的相互作用，将 构 建 好 的 载 体 转 入 酵 母 菌 ，其在 培养基上可以正常生长，且 在 和 培养基上正常生长并形成蓝色菌斑，其阳性对照 也可以形成蓝色菌斑，而阴性对照 空载不能形成蓝色菌斑，证明 可自激活，说明 不能用于酵母双杂交系统。转录因子 的 末 端 拥 有 非 典 型 螺 旋 环 螺 旋（）结构域，但 转录因子与 转录因子没有同源性，并结合不同于 转录因子识别的 结构域。根据蛋白质二、三级结构预测，属于非典型的 蛋白。研究显示类和 类 的分子机制可能在拮抗关系中发挥作用。可能与它相互作用的蛋白 ，充当靶基因转录的激活子或抑制子。等的类 抑制茉莉酸生物合成基因 （脂氧合酶，），类 则可以激活其表达。随着 丰度的增加，的表达量以及茉莉酸产量在叶片发育后期增加。在叶片发育的早期，茉莉酸通过抑制细胞草地学报第 卷增殖影响细胞增殖向细胞膨胀转变，而在叶片发育的晚期，茉莉酸诱导叶片衰老（图）。表达模式结果显示，该基因在叶片中大量表达，与根系和茎的表达量存在显著差异，且相对于成熟和衰老