人源诱导多能干细胞体外定向...化为功能性肝细胞的方法研究_邵文桂.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.02.005人源诱导多能干细胞体外定向分化为功能性肝细胞的方法研究*邵文桂1张阳2阮海文2窦金辉2张雪峰2赵树立1（1 中国药科大学南京市第一医院 江苏 南京 201106；2 江苏鼎泰药物研究股份有限公司 江苏 南京 211800）摘要 目的：研究开发一种简易、快速在体外使多能诱导干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）定向分化为功能性肝样细胞的培养方法。方法：根据正常肝细胞在体内的发育规律，设计简化诱导方法使 iPS 细胞定向分化为内胚层细胞，应用 qPCR 和流式细胞术鉴定其纯度后进一步诱导分化为肝样细胞，并通过 qPCR、ELISA、免疫荧光等技术鉴定肝细胞的性状和功能。结果：iPS 细胞诱导 7 天后，OCT4 和 NANOG 的表达水平显著下降，内胚层细胞相关基因 CXCR4、FOXA2 和 HNF4A 表达水平明显升高。内胚层细胞继续诱导培养 15 天后，肝细胞特异性标志基因 ALB、TDO2、RBP4、G6PC 和肝药酶基因 CYPs 等显著上调，同时产生高水平的白蛋白和尿素；PAS 糖原染色为阳性，能主动摄取和释放吲哚菁绿，证实诱导成的肝样细胞具备正常肝细胞的部分功能。结论：该诱导方案能够在体外使 iPS 细胞遵循正常肝脏发育通路简易、高效地分化为功能性肝细胞。本研究为大量获得 iPS 来源的肝细胞及其在细胞疗法和药筛模型中的运用提供了可能性。关键词：多能诱导干细胞；内胚层；定向分化；肝细胞；药筛模型中图分类号：R-33；R329.2文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）02-225-07Study on the Method of Directional Differentiation of Human InducedPluripotent Stem Cells into Functional Hepatocytesin Vitro*SHAO Wen-gui1,ZHANG Yang2,RUAN Hai-wen2,DOU Jin-hui2,ZHANG Xue-feng2,ZHAO Shu-li1(1 Nanjing First Hospital,China Pharmaceutical University,Nanjing,Jiangsu,201106,China;2 Jiangsu Dingtai Pharmaceutical Research Co.,LTD.,Nanjing,Jiangsu,211800,China)ABSTRACT Objective:This study is to research and develop a simple and rapid method to directly differentiate the inducedpluripotent stem cells(iPS)into functional hepatocytes in vitro.Methods:According to the development of normal hepatocytes in vitro,asimplified method was designed for differentiation of iPS cells into endodermal cells.The phenotypes of endodermal cells was identifiedby qPCR and flow cytometry,and then these cells were further differentiated into hepatocyte-like cells.The characteristics and functionsof hepatocytes were identified by qPCR,ELISA and immunofluorescence.Results:The results showed that the mRNA/protein expressionofOCT4 and NANOG were decreased significantly,and the mRNA/protein expression of endodermal cell-related genes,CXCR4,FOXA2and HNF4A,were increased significantly at day 7 after iPS cell induction.Hepatocyte specific marker genes ALB,TDO2,RBP4,G6PCand hepatocyte drug enzyme genes CYPs were significantly upregulated at day 15,and high levels of albumin and urea were producedsimultaneously.Positive PAS glycogen staining and active uptake and release of indocyanine green were observed in the induced hepato-cytes.It was confirmed that the hepatocyte-like cells had the partial functions of primary hepatocytes.Conclusion:This easy and efficientinduction method can be used in differentiation of iPS cells into functional hepatocytes by mimicking the process of liver organogenesisin vitro.This study provides the possibility for massive production of iPS-derived hepatocytes and their applications in cellular therapyand drug screening models.Key words:Pluripotent induced stem cells;Endoderm;Directional differentiation;Hepatocytes;Drug screening modelChinese Library Classification(CLC):R-33;R329.2Document code:AArticle ID:1673-6273(2023)02-225-07*基金项目：南京市科技计划项目（201911001）作者简介：邵文桂（1995-），女，硕士研究生，主要研究方向：基础医学与临床药学方向，E-mail:通讯作者：张雪峰（1979-），男，博士，主要研究方向：主要从事于药物毒理研究及安全药理方向，电话：025-58196598，E-mail:zhangxuefengtri-；赵树立（1979-），男，博士，副研究员；研究方向：主要从事于肿瘤微环境成分分析及其介导的免疫逃逸机制和天然免疫介导的肿瘤免疫治疗技术开发，电话：025-52887003，E-mail:（收稿日期：2022-06-15 接受日期：2022-07-10）前言肝细胞作为肝脏功能最基本的单位，在药物代谢、药物相互作用以及毒理药理研究领域被广泛应用1。临床治疗终末期225现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023肝病需要进行器官移植，但由于器官来源困难且可能有免疫排斥反应，所以肝细胞移植（Hepatocyte transplantation，HT）是治疗以肝脏为基础的代谢性疾病和急性肝衰竭（Acute liver fail-ure，ALF）的一种有前途的替代方案2。但肝细胞来源非常有限，且无法在体外长期培养，亟需寻找新的来源并可长期体外培养的肝细胞，以期建立人肝脏代谢的体外模型并满足临床需求。目前体外诱导肝样细胞的种子细胞来源主要有胚胎干细胞（ESCs）和多能干细胞（iPSCs）1，其中 iPSCs 开始越来越多受到研究者们的关注3。2006 年，日本科学家 Yamanaka 的研究小组发现，通过转导 Oct-3/4，Sox2，c-Myc 和 Klf4 这 4 个转录因子将小鼠的皮肤细胞重编码为具有胚胎干细胞功能的干细胞，被称为多能诱导干细胞4。后用类似的方法，又将人类成纤维细胞，以及脐带和外周血细胞成功诱导为 iPS 细胞5,6。干细胞可以在体外重新分化，产生有助于药物发现的新模型，包括基于iPS 的药物发现、毒性评估和疾病建模模型7,8。另外 iPS 细胞相比胚胎干细胞来说，没有伦理压力和人类白细胞抗原（Humanleukocyte antigen，HLA）不匹配的问题，提供了可避免免疫排斥的潜在可行的细胞替代疗法，成为新的肝细胞的理想可能来源9。在胚胎发育过程中，肝细胞来自于内胚层10。体外培养可诱导细胞分泌白蛋白（Albumin，ALB），同时其发挥作用也必须建立在内胚层细胞诱导的基础上11。IPS 细胞向肝样细胞的诱导分化主要是通过模拟肝脏在体内的发育过程，根据肝细胞在体内发育不同时期的调控机制，人为在体外创造肝细胞所需的体内微环境，经过内胚层发育、内胚层肝脏特异化和肝脏成熟三个阶段来获得肝细胞样细胞（Hepatic-like cells，HLCs）12。在诱导分化肝细胞过程中，细胞因子的作用不可或缺13。细胞因子是一类由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的具有广泛生物活性的小分子蛋白质14。在以往大部分研究方案中，研究者通常将 HLC 的分化方案分为三个步骤：内胚层分化、肝母细胞分化以及肝样细胞分化15，所用到的细胞因子包括肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、磷酸肌醇 3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PIK3）以及 Wnt3a 在内的内胚层诱导因子16；成纤维细胞生长因子（Fibroblast growthfactors，FGF）13、骨形成蛋白（bone morphogenetic Proteins，BMP）以及抑瘤素（Oncostatin M，OsM）在内的肝细胞诱导因子17。以往方案步骤繁琐，耗费的细胞因子种类多，数量大，价格昂贵，所以寻找更为简易的方案，减少细胞因子的耗费是研究建立大量诱导分化肝样细胞工艺必不可少的环节18。在本研究中，研究者在前人研究基础上，通过缩短诱导周期、减少诱导因子的两步法诱导方案，短期高效诱导出具备良好肝功能的功能性肝细胞，获得的这些功能性肝细胞可用于药物筛选及用药安全评估等方面的研究，为其在药物研究及再生医学领域中的应用奠定基础。1 材料和方法1.1 材料mTeSRTM1（STEMCELL）多能干细胞培养基，ROCK in-hibitor Y27632、ICG 粉末(均购于 MCE)，B27 添加剂、血清FBS，细胞解离试剂 Accutase（均购于 Gibco），MatrigelTM基质胶（购于 Corning），RIMP1640 培养基（购于 WAKO），ActivinA、ChiR 99021（均购于 BioTechne），Sodium Butyrate、Dexam-ethasone（Dex，均购于Sigma），HCM/EGM培养基（购于LONZA），Oncostatin M（OSM，购于 R&D），RNA 提取试