人参皂苷Rg1抗大鼠脑缺血再灌注损伤的机制研究_谭明.pdf

人参皂苷 抗大鼠脑缺血再灌注损伤的机制研究谭明，马雪飞，于文霞，刘跃，王佳乐，翟凤国（牡丹江医学院药理教研室，黑龙江 牡丹江）摘要：目的 探讨人参皂苷 对脑缺血再灌注（）损伤大鼠的作用及作用机制。方法 只 大鼠随机分为假手术组、脑 损伤模型组、人参皂苷 低剂量（）组、人参皂苷 高剂量（）组。假手术组、脑 损伤模型组大鼠腹腔内注射等量的 氯化钠注射液，人参皂苷 低、高剂量组腹腔内注射不同浓度的人参皂苷。大脑中动脉闭塞手术后，对 组大鼠进行运动神经功能缺损评分的比较；酶联免疫吸附测定法（）检测各组大鼠血浆中肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）以及白细胞介素（）的含量；技术检测各组大鼠皮层脑组织中 的表达；检测各组大鼠皮层脑组织中 蛋白以及介导的通路蛋白、的表达。结果 人参皂苷 预处理会降低脑（）损伤大鼠运动神经功能缺损评分，降低血浆、的含量以及皮层脑组织 、蛋白以及、蛋白的表达，呈剂量相关。结论人参皂苷 可能通过抑制 信号通路，减少脑 损伤大鼠炎症因子的释放，发挥神经保护作用。关键词：脑缺血；人参皂苷；炎症中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（）作者简介：谭明，硕士研究生，研究方向：心脑血管药理学通信作者：翟凤国，教授，硕士生导师，研究方向：心脑血管药理学，：，（，）：（），（，），（），（）（）（）（），（）：；尽早恢复缺血性脑卒中的血液灌注是治疗缺血性脑卒中的主要治疗手段。当前的治疗方式主要是静脉化学溶栓。然而，通过溶栓治疗恢复缺血区的血液再灌注常常会导致缺血组织及神经系统的病理损害进一步加重，病情恶化，造成脑缺血再灌注（）损伤。目前，临床上缺少有效防治脑缺血损伤的药物，因此，寻找有效的治疗药物迫在眉睫。人参被称为百草之王，已在中药中使用了数千年，是一种提高体力和活力的滋补药材，以补气养阴为主，具有增强机体免疫功能、抗炎、抗肿瘤、抗心脑缺血等广泛的药理作用。人参皂苷 是一种从人参中分离得到的纯化皂苷，是人参的主要提取物之一，有研究证实人参皂苷 具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理学活性，是近期研究中被认为是最有今日药学 年 月第 卷第 期，效的抗缺血性脑卒中药物之一。近年研究表明，通过动物模型以及细胞模型从不同角度发现人参皂苷 有治疗和改善阿尔茨海默病的作用，并具有多靶点、毒副作用小等优势；杜姝等也发现，人参皂苷 可以降低癫痫大鼠发作的等级。但人参皂苷 对脑 损伤的机制研究相对较少。因此本实验通过建立大鼠脑 损伤模型，研究不同剂量的人参皂苷 预处理对脑 损伤大鼠的影响，进一步探讨人参皂苷 抗脑 损伤的作用机制，为临床上预防、治疗脑 损伤以及研发新型药物提供新思路。实验材料 实验药物人参皂苷 由上海源叶生物技术有限公司提供。实验试剂大鼠白细胞介素（）试剂盒，大鼠白细胞介素（）试剂盒，大鼠肿瘤坏死因子（）试剂盒，提取试剂盒，逆转录试剂盒，化学发光底物试剂盒，试剂盒，抗体，抗体，抗体，抗体。实验动物健康 级（）大鼠 只，动物由牡丹江医学院比较医学中心提供，鼠龄 周，体质量（），动物合格证号：（黑）。实验方法与步骤 动物分组及给药所有 大鼠适应性饲养两周后，将其随机分为 组：分别为假手术组、模型组、人参皂苷 低剂量（）组及人参皂苷 高剂量（）组。假手术组与模型组每日 次腹腔内注射等量的氯化钠注射液。两组药物组每日 次腹腔内注射等量人参皂苷，连续给药 。动物造模末次给药 后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功之后将大鼠仰卧固定于手术操作台上，碘伏消毒颈部，大鼠颈正中部做切口，钝性分离皮下组织和肌肉，游离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈外动脉，用微动脉夹夹闭颈总动脉，于颈总动脉分叉下方剪 个 形切口，将准备好的尼龙线栓缓慢向前推进至颈内动脉约 处，感觉有轻微阻力感时，说明线栓此时已栓在大脑中动脉开口处，造成大脑中动脉局灶性脑缺血，停止插入栓线。当阻闭 后，将线栓缓慢拔出，恢复再灌注 ，造成大鼠脑 损伤。假手术组除了不插入线栓外，其余操作方法均与模型组和给药组相同。神经功能缺损评分的比较根据 等的评分标准对各组大鼠进行评分，分：无神经学征象，活动正常；分：提尾时，动物不能完全伸展左前肢；分：行走时身体向左侧转圈；分：动物行走向左侧倾倒；分：不能自发行走，有意识障碍。各组大鼠神经功能缺损评分分值越高，大鼠神经功能障碍越严重，神经功能缺损评分在 分为模型成功，用于后续实验。炎症因子水平检测按照 检测试剂盒中的操作步骤进行实验操作。分别检测各组大鼠血浆中、的含量，同时测定总蛋白浓度用以校正。法检测大鼠皮层脑组织中 的表达分离大鼠皮层脑组织并及时放置冰箱里冷冻。提取大鼠皮层脑组织中总，用超微量核酸蛋白测定仪测定 浓度。将提取的 逆转录成，经 荧光染料法对各组大鼠皮层脑组织中 的表达情况进行测定。内参选取，以 法来计算 表达情况。引物的序列，见表。表 荧光定量 扩增引物序列基因引物序列（）：检测大鼠皮层脑组织蛋白表达水平取各组皮层脑组织样本约为 ，加入 蛋白裂解缓冲液，用研磨棒充分研磨，摇床充分裂解，离心 ，取上清液即为脑组织蛋白。再用 试剂盒测定各组蛋白的浓度。将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后转至 膜上，用 脱脂奶粉封闭 后，洗膜 次，每次 ，再分别加入、稀释的一抗 孵育过夜，用 缓冲液洗涤 次，每次 ，二抗室温孵育，用 缓冲液洗涤 次，每次 ，最后，今日药学 年 月第 卷第 期用 化学发光试剂均匀滴在 膜上显色，化学发光成像仪曝光、显影、定影、取像再测定条带灰度值，以 为内参，软件定量分析，分别计算、蛋白相对表达。统计学处理方法用 软件对数据进行统计学分析，计量资料结果 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 检验，以 为差异具有统计学意义。结果人参皂苷 降低脑 损伤大鼠神经功能评分 经大鼠中动脉闭塞手术后，模型组大鼠神经功能缺损评分（）明显高于假手术组（，）；与模型组比较，应用人参皂苷 预处理会降低大鼠运动神经功能缺损评分（，），而应用人参皂苷 预处理会显著降低大鼠神经功能缺损评分（，），见图。人参皂苷 对大鼠血浆内炎症因子的影响结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠血浆中、的含量明显提高（）；与模型组比较，人参皂苷 预处理会显著降低大鼠血浆中、的含量（），呈剂量相关，见图。#*1234神经功能评分的比较3210注：模型组与假手术组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，。假手术组；模型组；人参皂苷；人参皂苷。图 各组大鼠运动神经功能缺损评分的比较#*#*#*大鼠血浆中I L-6 的含量1 5 01 0 05 00大鼠血浆中I L-1 的含量6 0 04 0 02 0 00大鼠血浆中T N F-的含量1 0 08 06 04 02 00123412341234注：模型组与假手术组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，。假手术组；模型组；人参皂苷；人参皂苷。图 各组大鼠血浆中、的含量的表达人参皂苷 对大鼠皮层脑组织中 的影响 与假手术组比较，模型组会使大鼠皮层脑组织中 的表达显著提高（）；与模型组大鼠比较，人参皂苷 预处理的大鼠会使大鼠皮层脑组织中 的表达显著降低（），呈剂量相关。见图。人参皂苷 对大鼠皮层脑组织 蛋白的影响 与假手术组比较，模型组会使大鼠皮层脑组织中 蛋白的表达明显提高（）；与模型组大鼠比较，人参皂苷 预处理大鼠皮层脑组织中 蛋白的表达降低（），而应用人参皂苷 预处理大鼠皮层脑组织中 蛋白的表达显著降低（），呈剂量相关。见图。#*1234T L R 4 m R N A的表达2.01.51.00.50.0注：模型组与假手术组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，；人参皂苷 组与模型比较，。假手术组；模型组；人参皂苷；人参皂苷。图 各组大鼠皮层脑组织中 的表达今日药学 年 月第 卷第 期，12341234T L R 4/-a c t i n0.60.40.20.0T L R 4-a c t i n#*注：模型组与假手术组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，；人参皂苷 组与模型比较，。假手术组；模型组；人参皂苷；人参皂苷。图 各组大鼠皮层脑组织 蛋白的表达人参皂苷 对大鼠皮层脑组织 信号通路蛋白的影响 与假手术组比较，模型组会提高大鼠皮层脑组织中 蛋白的表达（），而 蛋白的表达明显提高（）；与模型组大鼠比较，应用人参皂苷 预处理大鼠会降低、蛋白的表达（），而应用人参皂苷 预处理大鼠会显著降低、蛋白的表达，呈剂量相关。见图。1234123412341234T R I F-a c t i nT L R 3-a c t i nT L R 4/-a c t i nT L R 3/-a c t i n2.01.51.00.50.02.01.51.00.50.0#*#*注：模型组与假手术组比较，、；人参皂苷 组与模型组比较，；人参皂苷 组与模型组比较，。假手术组；模型组；人参皂苷；人参皂苷。图 各组大鼠皮层脑组织、蛋白的表达 讨论脑 损伤是指脑组织缺血一段时间后，血液恢复供应，并加剧由脑组织局部缺血造成的伤害，脑组织结构损伤加重，造成不可逆损伤。当脑 损伤发生时，脑内产生一系列的复杂的变化，包括：钙离子超载、氧自由基的生成、神经元凋亡等，而各种机制之间又相互影响，相互作用，最后导致病情加重。近年来，脑 损伤的机制研究越来越受到国内外学者的关注。有报道称，通过靶向调控、等常见凋亡信号，可以抑制细胞的过度凋亡，起到神经保护作用；王林琳等研究发现，可以通过调节铁死亡和炎症反应减轻脑 损伤。本研究采用颈内动脉线栓法致大脑中动脉阻塞引起大鼠脑 损伤模型，结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显提升，这与饶政清等的实验结果一致，表明大鼠脑 损伤模型建立成功。中药以其多成分、多途径、多靶点等发挥药效的优势已对治疗脑缺血损伤具有明显的神经保护作用。天然产物因其结构多样性和独特性，在缺血性脑损伤的治疗中占有非常重要的地位，从天然产物中寻找具有抗脑 损伤作用的活性成分具有极大的潜力。有报道称人参皂苷 对大鼠缺氧缺血性脑损伤和神经元凋亡具有保护作用；也有研究发现人参皂苷 通过抑制 信号通路减轻脑缺血损伤大鼠的脑梗死体积，本研究证实，人参皂苷 可显著降低大鼠神经功能缺损评分，说明人参皂苷 对脑 损伤大鼠的神经功能恢复起着重要的作用。然而，脑 损伤发生机制十分复杂，可能涉及不同的靶点、通路、机制。因此，本研究将从分子生物学的角度继续阐明人参皂苷 抗脑 损伤的可能机制，为临床上治疗脑 损伤的患者提供理论基础。样受体（）是天然免疫系统中研究最为广泛的识别系统，广泛分布于中枢神经系统中。近年研究发现，与脑缺血的发生发展密切相关，其表达水平受缺氧、炎症因子等内源或外源性刺激因素影响。有研究发现中脑动脉闭塞小鼠阻断 或敲除 基因后可有效减少小鼠脑缺血梗死面积，而敲除 和 基因的小鼠则无此神经保护作用。本实验发现，大鼠脑 损伤会使 以及蛋白的表达明显提高，说明 参与了脑 损伤的过程，而激活 能够介导炎症因子与趋化因子释放。笔者检测了脑 损伤模型大鼠血浆中、的含量，发现与假手术组比较，脑 损伤组会显著提高大鼠血浆中炎症因子的含量，说明当脑 损伤发生时，脑内炎症通路激活，使脑内的炎症因子水平显著提高，而其中必然涉及 介导的信号通路。，今日药学 年 月第 卷第 期 可依赖 进行信号转导，与 胞内段的 结构域结合后，诱导 活化，引起干扰素调节因子（，）磷酸化，被激活后转入细胞核，从而诱导 基因的表达，导致 的产生与释放，并最终诱导相关炎症因子的表达。有研究发现 信号通路与乳腺癌细胞的生长有关，通过抑制 信号通路可以抑制乳腺癌细胞的活性；也有研究发现通过抑制 信号通路可以改善脂多糖诱导的血管平滑肌细胞炎症，对心血管疾病具有积极的作用。而人参皂苷 是否通过介导 信号通路发挥抗脑 损伤的作用有待阐明，因此本实验检测了人参皂苷 预处理大鼠皮层脑组织中、蛋白的表达以及血浆中炎症因子的表达，发现人参皂苷 预处理可明显降低脑 损伤大鼠血浆中、的含量以及皮层脑组织、蛋白