热敏蛋白TRPV1在小鼠睾丸生精小管中的表达特征_赵妍秋.pdf

中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-10-13 修回日期2022-12-08基金项目国家自然科学基金（31871515）；陕西省卫生健康科研项目（2022A012）；陕西省重点研发计划项目（2021SF-055）作者简介赵妍秋，女（1998 年），汉族，硕士研究生*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：;xiaofang-热敏蛋白TRPV1在小鼠睾丸生精小管中的表达特征赵妍秋1,2，刘博2,3，魏金花2*，李臻2*（1延安大学医学院组织学与胚胎学教研室，延安 716000；2空军军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室，西安 710032；3中国人民解放军中部战区空军医院，大同 037000）摘要目的 明确热敏蛋白TRPV1在生后发育小鼠睾丸的表达和定位。方法 采用定量PCR和蛋白免疫印迹方法检测TRPV1 在生后发育小鼠睾丸中的表达水平，采用免疫组织化学染色方法观察 TRPV1 在成年小鼠睾丸生精上皮不同周期的表达，采用免疫荧光双标染色分析 TRPV1 在成年小鼠睾丸各类生精上皮细胞中的定位。结果 荧光定量 PCR 和蛋白免疫印迹检测显示，TRPV1 在小鼠出生后 7 d 的睾丸中已有表达，在 21 d 时其表达水平显著上升，在 28 d 达到顶峰，之后随小鼠发育至成年阶段其表达量逐渐降低；免疫组织化学染色显示，TRPV1 在成年小鼠睾丸生精上皮的各个周期均有表达，并且从IV 期开始表达量增加。免疫荧光双标染色显示，TRPV1 在成年小鼠睾丸 SOX9 阳性的支持细胞、PLZF 阳性的精原细胞和SYCP3 阳性的精母细胞均有表达，并在初级精母细胞表达量较高。结论 TRPV1 在小鼠睾丸生后发育的早期即开始表达，并且在生精上皮各类细胞中有广泛表达，提示其可能在生精细胞的发育过程中具有重要作用。关键词TRPV1；睾丸；生精细胞；精母细胞中图分类号R329 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.001The expression pattern of thermosensitive protein TRPV1 in the spermatogenic tubules of mouse testisZhao Yanqiu1,2,Liu Bo2,3,Wei Jinhua2*,Li Zhen2*(1Department of Human Histology and Embryology,Medical School of Yanan University,Yanan 716000,China;2Department of Human Anatomy and Histo-embryology,Air Force Medical University,Xian 710032,China;3The Air Force Hospital of Central Theater of PLA,Da tong 037000,China)AbstractObjective To clarify the expression and localization of the thermosensitive protein TRPV1 in the testes of postnatal developing mice.Methods The expression levels of TRPV1 in the testes of postnatal developing mice were detected by quantitative PCR(qPCR)and immunoblot,the expression of TRPV1 in different cycles of spermatogenic epithelium of adult mouse testes,the expression of TRPV1 in different stages of adult mouse testicular spermatogenic epithelium was examined by immunohistochemical staining,and the precise localization of TRPV1 in adult mouse testicular spermatogenic epithelium was analyzed by double immuno-fluorescent staining.Results The results of qPCR and immunoblotting showed that TRPV1 was expressed in the testis of mice at 7 d after birth,and its expression level increased significantly at 21 d and peaked at 28 d.After that,its expression level decreased gradually as mice developed into adults.Besides,TRPV1 was expressed in SOX9-positive Sertoli cells,PLZF-positive spermatogonia and SY-CP3-positive spermatocytes of adult mouse testis,and its expression level was relatively higher in primary spermatocytes.Conclusion TRPV1 begin to express in the early stage of mouse testis development and is widely expressed in different testicular cells,suggesting that it may have important roles in normal spermatogenesis.KeywordsTRPV1;testis;spermatogenic cells;spermatocytes中国组织化学与细胞化学杂志540第 31 卷正常的精子发生过程对于维持物种的繁衍稳定至关重要，睾丸生精上皮是正常的精子发生过程的场所。精子的发生过程包括精原细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂以及精子细胞的成熟。这些过程受到激素、旁分泌因子、基因和表观遗传调控因子等内在因素的参与调控1，同时外界环境因素，例如辐射，重金属和有害的化学物质，以及不良生活习惯也会影响精子发生过程2。其中，环境温度的变化对于精子的发生过程具有重要影响3。睾丸的温度通常保持低于身体核心温度 26，当睾丸温度升高或机体体温调节障碍时，导致精子生成减少4，诱导生殖细胞凋亡和 DNA 损伤，影响精子质量，造成雄性不育或者生育力降低5。瞬时受体电位香草酸亚型 1（transient receptor potential vanilloid receptor-1,TRPV1）是一种广泛存在于哺乳动物体内的热敏通道，可以被高温（43 C）、细胞外酸性环境和辣椒素等配体激活6，并且这些因素可以协同促进 TRPV1 活性7。TRPV1 属于非选择性阳离子通道，对 Na+和 Ca2+有较高通透性，在口腔和皮肤等器官中参与炎症和疼痛等过程8。除此之外，TRPV1 在非感觉神经元中有具有重要作用，广泛参与细胞增殖、凋亡和体内多种生理病理过程9。另有研究发现 TRPV1 在人和大鼠的前列腺、睾丸、阴茎和膀胱组织中有表达10，但其在小鼠睾丸中的具体细胞定位尚无系统研究。本研究采用实时荧光定量 PCR（qPCR）、蛋白免疫印迹、免疫组织化学染色和免疫荧光双重染色技术，检测 TRPV1在小鼠睾丸发育阶段和生精周期的表达，以及其在小鼠睾丸各生精上皮中的定位情况，为今后深入研究其在睾丸热应激中的功能与作用提供基础。材料与方法1 实验动物出生后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、56 d SPF级 C57 小鼠各 3 只，体重（2010）g 成年小鼠 20只，均购自空军军医大学实验动物中心。2 主要试剂RNA 提取液 Trizol plus、反转录试剂盒 PrimeS-cript RT reagent Kit和荧光定量试剂盒SYBR Prim-ix Ex Taq II均购自日本 Takara公司；定量PCR 所用引物由武汉奥科生物技术有限公司合成；免疫组织化学染色试剂盒 VECTASTAIN ABC Kit 购自美国 Vector Laboratories 公司；兔抗 TRPV1（ab31895）和鼠抗SYCP3（ab97672）购自 Abcam 公司；鼠抗 SOX9(14-9765-95)购自美国 Invitrogen 公司；鼠抗 PLZF（sc-28319）购自Santa Cruz公司；鼠抗-actin（T0022）购自 Affinity 公司；山羊抗小鼠 IgG（ZB-2305）购自中杉金桥；山羊抗兔 IgG（SGA10002）购自AntiProtech公司；FITC 标记的羊抗鼠和 TRITC 标记的羊抗兔二抗购自美国 Jackson ImmunoResearch 公司。3 动物取材小鼠脱颈处死，取一侧睾丸用于提取 RNA 和蛋白，另一侧睾丸固定于4%多聚甲醛（多聚甲醛4 g，PBS溶液100 mL，加热搅拌溶解后用10 mmol/L NaOH 溶液调pH为 7.4），用于免疫组织化学和免疫荧光染色。4 总 RNA 提取采用TRIzol法提取总RNA。收集的睾丸组织加入 1 mL TRIzol 溶液，充分吹打，冰上裂解 5 min。加入 0.2 mL 氯仿，颠倒混匀，12000 r/min、4 离心 15 min；转移上清到新 Eppendorf 管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀；-20 冰箱放置 30 min，13500 r/min、4 离心 10 min；弃上清，加入 1 mL 75%乙醇，颠倒混匀，13500 r/min、4 离心 10 min；弃上清，离心管开盖室温放置直至液体完全挥发；加入适量 DEPC 水，溶解 RNA 沉淀。Nano-Drop-2000 分光光度计测定 RNA 纯度和浓度，取吸光度 A260/A280=1.82.0 的样品进行逆转录。5 逆转录 PCR琼脂糖凝胶电泳法检测：用 PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒进行 RT-PCR。10 L 基因组 DNA去除反应体系如下：2 l 5gDNA Eraser Buffer，1 L gDNA Eraser，2 g RNA，RNase Free dH2O 定容；反应条件 42 C，2 min。20 L 反转录反应体系如下：4 L 5PrimeScript Buffer 2（for Real Time），1 L PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 L RT Primer Mix，10 L 上一步反应液，4 L RNase Free dH2O；反应条件：37 C 15 min，85 C 5 s。以cDNA为模板进行目的基因的 PCR 扩增，20 L 反应体系，反应条件为 95 5 min，94 30 s，58 30 s，72 60 s，72 延伸10 min，第二步至第 4步35 个循环；TRPV1上游引物为：5-TCTGCTGGAATCCTCGGGTGT