群结腐霉细胞壁降解酶的活性检测及基因表达分析_陈一帆.pdf

18郑赟，王昊宁，刘靖文，等 牡丹花发育相关基因 PsPI 的克隆与表达分析J 分子植物育种，2021，19(7):2185 2192 19Estruch J J，Kadwell S，Merlin E，et al Cloning and characterizationof a maize pollen specific calcium dependent calmodulin independent protein kinase JProceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，1994，91(19):8837 8841 20Yoon G M，Dowd P E，Gilroy S，et al Calcium dependent proteinkinase isoforms in petunia have distinct functions in pollen tubegrowth，including regulating polarityJ The Plant Cell，2006，18(4):867 878 21麻浩，王爽，周亚丽 植物中钙依赖蛋白激酶的研究进展 J 南京农业大学学报，2017，40(4):565 572 22 丁艳芬 玉米 ZmCPK11 在 ABA 诱导的抗氧化防护中的功能分析D 南京:南京农业大学，2012 23 Fedosejevs E T，Gerdis S A，Ying S，et al The calcium dependentprotein kinase RcCDPK2 phosphorylates sucrose synthase at Ser11indeveloping castor oil seeds J The Biochemical Journal，2016，473(20):3667 3682 24 王娇娇，韩胜芳，李小娟，等 钙依赖蛋白激酶(CDPKs)介导植物信号转导的分子基础J 草业学报，2009，18(3):241 250陈一帆，薛太强，陈思桥，等 群结腐霉细胞壁降解酶的活性检测及基因表达分析J 江苏农业科学，2023，51(4):46 51doi:10 15889/j issn1002 1302 2023 04007群结腐霉细胞壁降解酶的活性检测及基因表达分析群结腐霉细胞壁降解酶的活性检测及基因表达分析陈一帆1，2，薛太强2，陈思桥2，张金凤2，周冬梅2，魏利辉1，2(1 江苏大学环境与安全工程学院，江苏镇江 212013;2 江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京 210014)摘要:群结腐霉(Pythium myriotylum)是一种死体营养型病原菌，可侵染生姜引起茎基腐病，造成生姜产量损失，严重危害该产业发展。群结腐霉含有大量植物细胞壁降解酶(plant cell wall degrading enzymes，PCWDEs)，然而PCWDEs 在群结腐霉侵染生姜过程中的功能和特性却鲜有报道。运用生物信息学手段预测群结腐霉细胞壁降解酶的种类和数量，并以生姜粉末和葡萄糖为碳源，比较菌丝生长的情况，利用转录组分析比较 PCWDEs 基因在不同碳源条件下的表达差异情况，同时对培养液中主要 PCWDEs 进行酶活检测。转录组数据显示，与葡萄糖培养基相比，生长在生姜粉末培养基上的群结腐霉中 12 个 PCWDEs 编码基因显著上调表达，利用 CAZymes 网站预测 PCWDEs 的底物主要为淀粉和纤维素;酶活检测发现，其中 葡萄糖苷酶和 葡萄糖苷酶活性较高，分别降解淀粉和纤维素。结果表明，群结腐霉在生姜粉末上生长过程中的 PCWDEs 以淀粉降解酶和纤维素降解酶为主。关键词:群结腐霉;植物细胞壁降解酶;转录组;酶活中图分类号:S436 32文献标志码:A文章编号:1002 1302(2023)04 0046 06收稿日期:2022 04 12基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项(编号:CARS 24 C 01)。作者简介:陈一帆(1997)，男，浙江温州人，硕士研究生，主要从事生姜茎基腐病害的研究。E mail:13738370562163 com。通信作者:魏利辉，博士，研究员，博士生导师，主要从事蔬菜病害绿色防控研究。E mail:weilihui jaas ac cn。生姜(Zingiber officinale Rosc)是一种重要的经济作物，广泛种植于热带和亚热带地区1。中国是世界上生姜栽培面积最大且生产总量最多的国家之一，也 是 全 球 生 姜 出 口 大 国。由 群 结 腐 霉(Pythium myriotylum)侵染引起的生姜茎基腐病，是生姜主要病害之一2，对生姜产业造成了巨大的经济损失3 4。该病害在生姜上的症状出现在地下根茎部位，表现为水渍状褐色病变，导致块茎腐烂、叶片变黄，最终使生姜萎蔫和坏死5。群结腐霉在世界各地都有分布，寄主范围广泛，除了生姜外还可以侵染花生等多种作物6。植物病原菌按营养摄取方式可分为 3 种类型:活体营养型、死体营养型和半活体营养型7。活体营养型病原菌在其整个生命周期内从活的寄主细胞内摄取营养;死体营养型病原菌从死亡(或垂死)的寄主细胞中摄取营养;半活体营养型病原菌最初从活体寄主细胞摄取营养，然后转变为从死亡的寄主细胞中摄取营养。对 3 种类型病原菌分泌的植物细胞壁降解酶(plant cell wall degrading enzymes，PCWDEs)数量进行比较发现，死体营养型病原菌中的 PCWDEs 数量最多;其次，半活体营养型病原菌，最少的是活体营养型病原菌7。PCWDEs 主要包含3 种碳水化合物活性酶(CAZymes)，分别是糖苷水64江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期解酶(GH)、碳水化合物酯酶(CE)和多糖裂解酶(PL)8。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶和结构蛋白组成9，是阻止病原菌入侵的主要物理屏障10 12。病原菌分泌的大量 PCWDEs(如:纤维素酶，果胶酶，蛋白酶和木聚糖酶)可降解不同细胞壁组分，促进其侵染13。纤维素和淀粉是生姜根茎中最主要的 2 种多糖14，其中，纤维素是植物细胞壁的主要成分。病原菌产生的纤维素酶在其侵染植物和定殖的过程中起到重要作用15。纤维素酶如 1，4 葡聚糖水解酶、内切葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶可降解纤维素生成葡萄糖，协同降解寄主细胞壁16。淀粉是植物中最重要的多糖之一，生姜根状茎中的淀粉含量约 11 4%。不同种类的生姜淀粉中的直链淀粉所占的比例不同(约占 18%30%)，与马铃薯淀粉相似17。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等18，分解直链淀粉后的最终产物以麦芽糖为主，同时还有麦芽三糖及少量葡萄糖。群结腐霉属于死体营养型病原菌，基因组中含有大量 PCWDEs 编码基因19 20，然而目前对这些PCWDEs 的功能和特性知之甚少。本研究以群结腐霉在生姜粉末和葡萄糖培养基上生长的菌丝和环板中的培养液为材料，利用 PCWDEs 基因功能注释、转录组测序分析和酶活检测等方法，研究群结腐霉 PCWDEs 基因表达情况和酶活特征，从而深入探究群结腐霉侵染生姜的致病机制，为该病害的防控提供理论参考。1材料与方法1 1试验材料11 1供试菌株本试验于 2021 年 3 月在江苏省农业科学院中进行，供试菌株群结腐霉 SWQ721 从山东生姜病样中分离得到，保藏于江苏省农业科学院植物保护研究所蔬菜病害防控实验室。1 1 2培养基的配制V8 培养基21:V8 蔬菜汁340 mL，CaCO33 4 g，5 000 r/min 离心 10 min 后弃沉淀，按 1 9 的体积比加入蒸馏水，琼脂 1 5%，121 灭菌 20 min。Plich 液体培养基22:KH2PO40 5 g，MgSO47H2O 0 25 g，(NH4)2SO45 g，L 天冬酰胺 1 g，谷甾醇 0 01 g，使用 NaOH 调 pH 值至 6 0，1 000 mL 超纯水，121 灭菌 15 min，加入硫胺素0 001 g。1 1 3主要试剂葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司;生姜粉末，山东省万兴食品有限公司;V8 蔬菜汁，美国金宝汤公司;0 1 m 孔径的聚碳酸酯膜，美国 GVS 过滤技术公司;对硝基苯酚，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司;对硝基苯基 D 吡喃葡萄糖苷，上海麦克林生化科技有限公司;对硝基苯基 D 吡喃葡萄糖苷，上海麦克林生化科技有限公司;对硝基苯基 D 吡喃木糖苷，上海麦克林生化科技有限公司;TruSeq Stranded mRNA 试剂盒，因美纳科学器材有限公司。1 1 4主要仪器单人双面垂直净化工作台，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;pH 计，上海奥豪斯仪器有限公司;电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司;恒温培养箱，上海善治仪器设备有限公司;生物分析仪，安捷伦科技有限公司;酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。1 2试验方法1 2 1植物细胞壁降解酶类注释使用生物学软件 dbCAN2(http:/bcb unl edu/dbCAN2/)分析蛋白质是否有 CAZy 结构域，预测碳水化合物活性酶的 基 因。利 用 CAZy 网 站(http:/www cazyorg/)23，根据 CAZy 家族或亚家族分类推测含CAZy 结构域蛋白的对应活性。PCWDEs 指推测活性作用于植物细胞壁多糖组分或植物贮藏多糖的蛋白质，根据推测的活性列出底物。1 2 2环板试验将群结腐霉 SWQ7 转接到含100 g/mL 氨苄青霉素的过滤 V8 培养基平板上，黑暗条件下于 25 培养箱中生长 2 d。本研究中使用一种称为环板的新型培养技术24。在 环 板 的 6 个 环 形 通 道 中 加 入 含 有100 g/mL 氨苄青霉素和适当碳源的 Plich 液体培养基，将聚碳酸酯膜覆盖在环板培养皿上，菌株转接在聚碳酸酯膜上生长，分别使用葡萄糖和生姜粉末作为碳源，制备浓度为 1 mol/L 葡萄糖原液并使用过滤灭菌，生姜粉末加入 Plich 培养基后高压灭菌。环板培养液中的葡萄糖最终浓度为 25 mmol/L，生姜粉末的最终浓度为 1%。将高温灭菌的聚碳酸酯膜覆盖在环板上，在环板中心接种直径为 0 5 cm带有新鲜菌丝的 V8 琼脂块。25 培养箱中黑暗生长 72 h 后，分别收集环板中聚碳酸酯膜上的菌丝(用于转录组分析)和下方环形通道中培养液(用于酶活检测)，样品收集后立即放于液氮中速冻保藏。74江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期1 2 3RNA 提取、RNA seq 文库制备、测序和数据分析RNA 的提取与纯化、RNA seq 文库制备及转录组测序由上海欧易生物医学科技有限公司完成。使用 Trizol 试剂提取样品中的 RNA，在 RNA样品中加入 DNA 酶去除残留的 DNA。RNA 的完整性采用生物分析仪来进行验证，使用分光光度计测量 RNA 纯度。通过 TruSeq Stranded mRNA 试剂盒制备 2 150 bp 的配对文库，并在 Illumina HiSeq X平台上进行测序。对原始数据利用 Trimmomatic 软件去除接头序列和低质量序列，获得高质量有效序列25。对处理后的序列采用 UseGalaxy eu 中的软件工具进行下游分 析26，采 用 HISAT2 Galaxy 将 序 列 映 射 至SWQ7 基因组进行组装27(https:/www ncbi nlmnih gov/genome/108473?genome _ assembly _ id=1746011)。使用 HTSeq count Galaxy 统计所有比对质量 10 序列，采用联合模式处理重叠多个特征的序列，在它们映射至所有特征上计算非唯一映射序列28。利用 DESeq2 Galaxy 对计数数据进行基因差异表达分析，其中，默