犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析_曾昊.pdf

53卷南 方 农 业 学 报 3266收稿日期：2022-03-07基金项目：国家自然科学基金项目（32160825）；广西研究生教育创新计划项目（YCSW2021031）通讯作者：陈樱（1980-），https:/orcid.org/0000-0001-6720-353X，博士，教授，主要从事宠物病毒性疾病研究工作，E-mail：第一作者：曾昊（1997-），https:/orcid.org/0000-0003-3783-5995，研究方向为宠物流感病毒分子生物学，E-mail：1918302038 犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析曾昊1，何剑桥1，崔柏杨1，郭嘉宁1，郭金凡1，周华波2，韦祖樟1，欧阳康1，黄伟坚1，陈樱1*（1广西动物疫病预防与控制重点实验室/广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；2南宁市华波宠物医院，广西南宁530004）摘要：【目的】明确犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征及致病性，为今后探究流感病毒的禽犬跨种传播机制提供科学依据。【方法】从流浪犬中分离H9N2亚型流感病毒，利用RT-PCR扩增其8个基因节段进行BLAST同源比对，然后基于国内外的22株参考毒株进行遗传进化分析，并通过小鼠滴鼻感染试验评估分离毒株的致病性。【结果】从采集的393份犬鼻拭子样品中分离获得1株H9N2亚型流感病毒，命名为A/canine/Guangxi/LZ11/2018（简写为LZ11）。分离毒株LZ11为三重组毒株，其中，HA、NA和NS基因属于BJ/94类谱系，PB2和M基因属于G1类谱系，PB1、PA和NP基因属于F/98类谱系；病毒基因组成属于近年我国广泛流行的S基因型。分离毒株LZ11的HA蛋白在第324331位存在1个裂解位点（PSRSSRGL），符合低致病性流感病毒的特征；HA蛋白还出现226QL突变，具有优先结合人类-2,6唾液酸受体的能力；NA蛋白在119E、151D、276E、292R和294N未发生突变，但M2蛋白出现31SN突变，说明分离毒株LZ11仍对神经氨酸酶抑制剂敏感，但已对金刚烷胺类药物产生耐药性；聚合酶蛋白出现多个哺乳动物适应性相关的氨基酸位点突变，包括PB2蛋白的292IV、PB1蛋白的368IV及PA蛋白的409SN和356KR。分离毒株LZ11虽然未引起小鼠出现典型的临床症状，但可在肺脏和上鼻窦有效复制，病毒滴度分别为3.82和5.98 lg PFU/mL。【结论】分离获得的犬源H9N2亚型流感病毒属于近年流行的S基因型，其8个基因节段分属于3种谱系（BJ/94类谱系、G1类谱系和F/98类谱系），且存在多个哺乳动物适应性相关氨基酸位点突变，具备感染哺乳动物的分子特征，可在小鼠脏器内有效复制。鉴于人类与宠物犬的密切关系，今后应加强对犬源H9N2亚型流感病毒的监测与防控。关键词：流感病毒；H9N2亚型；犬；遗传进化；致病性中图分类号：S852.659.5文献标志码：A文章编号：2095-1191（2022）11-3266-10南方农业学报Journal of Southern Agriculture2022，53（11）：3266-3275ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.11.028Genetic evolution and pathogenicity analysis of a canine-originH9N2 subtype influenza virusZENGHao1，HEJian-qiao1，CUIBo-yang1，GUOJia-ning1，GUOJin-fan1，ZHOUHua-bo2，WEI Zu-zhang1，OUYANG Kang1，HUANG Wei-jian1，CHEN Ying1*（1Key Laboratory of Prevention and Control for Animal Disease/College ofAnimal Science and Technology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi 530004，China；2Huabo Pet Hospital，Nanning，Guangxi 530004，China）Abstract：【Objective】To understand the characteristics of molecular variation of canine-origin H9N2 subtype influen-za virus and its pathogenicity in mice.It would provide the scientific evidence for the cross-species transmission of avian-canine.【Method】An H9N2 subtype influenza virus was isolated from stray dogs，eight of its gene segments were ampli-fied by RT-PCR for BLASThomology comparison，and then genetic evolution analysis was conducted based on 22 referencestrains at home and abroad，and pathogenicity of the isolated strains was evaluated by mouse nasal drip infection test.【Result】From collected 393 samples of dog nose swabs，one subtype H9N2 influenza virus strain was isolated，named11期32670引言【研究意义】流感病毒（Influenza virus）属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）负股单链RNA病毒，依据核蛋白抗原性的不同，可分为A型、B型、C型和D型（Compans et al.，1977；van de Sandt et al.，2015；Asha and Kumar，2019），其中A型流感病毒主要感染野生水禽，并将其作为天然宿主（Webster et al.，1992）。目前已鉴定出18个HA亚型和11个NA亚型的流感病毒（Tong et al.，2013；Zhu et al.，2013），其中H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）在我国大部分地区已呈地方性流行，在家禽及一些哺乳动物中以低致病性形式存在，并未引起广泛关注，但可持续在这些宿主中不断衍化以适应新宿主，对家禽和哺乳动物的毒力及传播力也不断增强。除了衍化成为具有结合人源受体特性和可通过气溶胶在雪貂间进行传播外（Wan et al.，2008），H9N2亚型流感病毒还可广泛承受同个亚型或不同亚型间基因片段的重配，从而产生携带不同H9N2亚型谱系片段的新基因型病毒（Su et al.，2015；Li etal.，2017）。犬呼吸道内同时拥有结合人流感和禽流感的受体（Wasik et al.，2017），可作为流感病毒的中间宿主。当2种或多种流感病毒同时存在于犬体内时，不同基因片段的重配会导致新型流感病毒产生。此外，犬作为人类的伴侣动物，在流感病毒的生态循环过程中发挥重要作用，当H9N2亚型流感病毒突破中间宿主屏障时势必会对人类的健康造成潜在威胁。因此，了解犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征和致病性，可为揭示H9N2亚型流感病毒突破禽人宿主屏障的分子机制提供科学依据。【前人研究进展】根据流感病毒8个基因片段的不同来源，Gu等（2014）对H9N2亚型流感病毒建立了一种基因型划分方法，以BJ/94类谱系的H9N2亚型为A基因型，基因片段来源不同则定义为其他基因型。按照这种划分方法，我国目前流行的H9N2亚型流感病毒至少可划分为23种基因型（AW）（Guan et al.，1999；Guet al.，2014；Liu et al.，2016）。最初，A基因型在我国H9N2亚型流感病毒中占主导到位，但1998年后H基因型（A基因型的PB2、PB1、PA和NP基因片段由F/98类谱系所替代）逐渐取代A基因型，成为优势基因型（Liu et al.，2003）。研究表明，F/98类谱系病毒较BJ/94类谱系病毒在鸡群中拥有更高的复制和传播力（Sun et al.，2010），因此H基因型拥有更强的禽类宿主适应能力。2007年出现的S基因型（在H基因型的基础上替换了G1类谱系的PB2和M基因片段）具有很强的传播性，可在家禽中稳定传播，成为目前我国H9N2亚型流感病毒的主要基因型（Gu et al.，2014）。H9N2亚型流感病毒能感染多种哺乳动物，包括犬、猫、雪貂和猪等（Wan et al.，2008；Yu et al.，2008；Sun et al.，2013；Zhou et al.，2015；孔子荣等，2020），更重要的是H9N2亚型流感病毒能跨越宿主感染人类（Sun and Liu，2015；Song and Qin，2020）。此外，H9N2亚型流感病毒可提供病毒基因，导致H5N1亚型流感病毒出现遗传多样性（Lei and Shi，2011），同时为H7N7、H5N2、H7N9和H10N8亚型流感病毒提供内部基因，产生新的基因型流感病毒（Li et al.，2014；Xu et al.，2015；Yang et al.，2017）。曾昊等：犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析A/canine/Guangxi/LZ11/2018（abbreviated as LZ11）.Genetic evolution analysis showed that LZ11 was a triple-ressortantstrain，which contained HA，NA and NS genes from BJ/94-like lineage，PB2 and M genes from G1-like lineage，PB1，PA and NP genes from F/98-like lineage，whose genetic composition belonged to S genotype circulating widely in Chinarecently.Sequence analysis showed that there was a cleavage site（PSRSSRGL）in the HA protein at position 324-331 ofLZ11 isolate，which was consistent with the characteristics of low pathogenic influenza virus.HA protein had226QL mu-tation，which preferentially bound human alpha-2,6 sialic acid receptors.There were no mutations in119E，151D，276E，292Rand294N in NA protein，while there was an31SN mutation occurred in M2 protein，indicating that the LZ11 isolate wassensitive to neuraminidase inhibitors but resistant to amantadine drugs.Multiple amino acid sit