人参灰霉病菌对咪鲜胺敏感性基线的建立及抗药性风险评估_乐默怡.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（，）通信作者李勇，研究员，研究方向为药用植物病害及其绿色防控技术，：；丁万隆，研究员，研究方向为药用植物栽培及病害综合防治，：人参灰霉病菌对咪鲜胺敏感性基线的建立及抗药性风险评估乐默怡，王蓉，李勇，刘燕敏，丁万隆（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京）摘要为了建立人参灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性基线，明确咪鲜胺抗性突变体的适合度以及人参灰霉病菌对咪鲜胺及灰霉病防治常用杀菌剂啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、异菌脲和嘧霉胺的交互抗性，该文采用菌丝生长速率法测定人参灰霉病菌对杀菌剂的敏感性；菌剂驯化及紫外线诱导法筛选咪鲜胺抗性突变体；通过继代培养稳定性、菌丝生长速率及致病力测定，明确抗性突变体的适合度；通过菌剂敏感性 相关性分析，明确咪鲜胺与 种灰霉病杀菌剂的交互抗性。结果表明，供试人参灰霉病菌均对咪鲜胺敏感，为.，均值.。敏感性频率分布图显示，株灰霉病菌位于主峰范围内，均为连续单峰曲线，将 均值.作为灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性基线。经室内药剂驯化和紫外线诱导，共获得 株抗药突变体，其中 株抗性不稳定，株多代培养后出现抗药性下降；抗性突变体的菌丝生长速率及产孢量均低于亲本，多数突变体的致病性也较亲本低。另外，咪鲜胺与啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、异菌脲和嘧霉胺均无明显交互抗药性。咪鲜胺用于人参灰霉病防控的潜力较大，灰霉病菌产生抗药性的风险较低。关键词 人参；灰霉病；咪鲜胺；抗药性；风险评估 ，（，），（），.，.，.，乐默怡等：人参灰霉病菌对咪鲜胺敏感性基线的建立及抗药性风险评估，；：.人参为五加科人参属药用植物人参 的干燥根和根茎，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效。我国是世界人参主要生产国，人参年产量约占世界人参总产量的，主产于吉林白山、通化、延边以及黑龙江黑河、牡丹江、伊春等地。人参灰霉病是由灰葡萄孢 引起的一种典型的气传病害，近年在人参产区发生普遍，局地发病率高达，对人参生产构成严重威胁。人参灰霉病菌具有传播速度快、寄主范围广、产孢量大、易发生变异、抗药性强等特点，目前，生产上灰霉病防治主要依赖化学杀菌剂。长期定向选择压力，导致人参灰霉病菌对多菌灵、嘧霉胺、异菌脲等常用灰霉病杀菌剂产生了不同程度的抗药性。咪鲜胺是一种咪唑类广谱型杀菌剂，通过抑制甾醇生物合成发挥抑菌作用。目前，该药已广泛用于尾孢属、核盘菌属、镰孢属以及白粉菌、炭疽菌等引起的农作物稻瘟病、白粉病、赤霉病、炭疽病等防治。据文献报道，咪鲜胺也可用于人参黑斑病防治。本研究发现，咪鲜胺对人参灰霉病菌有理想的抑制作用，尽管目前已经建立人参中咪鲜胺残留的检测方法及限量标准，但该药用于人参灰霉病防控的抗药性风险未见报道。为此，本研究采用菌丝生长速率法测定咪鲜胺抑制人参灰霉病菌生长的，建立人参灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性基线；经药剂驯化及紫外线诱导，获得咪鲜胺抗性突变体；结合继代培养稳定性、菌丝生长速率及致病力比较，分析抗性突变体的环境适合度；另外，测定了人参灰霉病菌对咪鲜胺及其他 种常用灰霉病杀菌剂的交互抗性。研究结果可为咪鲜胺用于人参灰霉病防控提供重要参考依据。材料.供试菌株供试 株人参灰霉病菌分别于 年和 年从吉林、黑龙江、辽宁采集的人参灰霉病叶上分离获得，菌株经单孢纯化后于 和 冰箱保存。.药剂及培养基：咪鲜胺（）原药购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；啶酰菌胺（）原药购自上海源叶生物科技有限公司；异菌脲（）原药购自上海毕得医药科技股份有限公司；嘧霉胺（）原药购自上海毕得医药科技股份有限公司；吡唑醚菌酯（）购自北京酷来搏科技有限公司；水杨羟肟酸（，）购自上海麦克林生化科技有限公司。用无水乙醇配制成母液（），其余均用丙酮制成母液，保存备用。马铃薯葡萄糖琼脂（）培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。.植物五年生人参来自吉林抚松，经中国医学科学院药用植物研究所丁万隆研究员鉴定为大马牙品种。方法.灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性测定采用菌丝生长速率法测定灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性。将人参灰霉病菌在 平板上活化培养 后，用打孔器打直径 菌饼，接种于含、.、.、.、.、.咪鲜胺的 平板中央，每皿 个菌饼。接菌后平板倒置于 恒温培养箱中黑暗培养 后，采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理 次重复，试验重复 次。按下列公式计算生长抑制率。生长抑制率对照菌落直径处理菌落直径对照菌落直径菌饼直径参考张晓柯等和杨坡等的方法，利用 软件以抑制率 的几率值为纵坐标，药剂浓度 为横坐标，计算。利用 软件作回归曲线及正态性检验。正态性检验中，.则说明在 置信限内敏感性呈近似正态分布，菌株 年 月第 卷第 期.，.，均值可作为敏感基线。.抗性突变体的获得.药剂驯化参考纪军建等的方法，随机选 取 菌 株、和，在 平板上预培养 后，打取直径 菌饼，分别梯度转接到含.、咪鲜胺的 平板，恒温诱导培养 ，每皿接种 个菌饼。选取在含 咪鲜胺的 平板上生长良好的菌株，转到无药平板继续培养，标记为 代。.紫外线诱导参考赵平等和范昆等的方法，随机选取菌株、和，在 平板上预培养 后，用打孔器取直径 菌饼，分别转至含、咪鲜胺的 平板，紫外灯垂直距离 照射、，立即置于黑暗培养 后，观察菌丝生长情况。随机选取菌株、和，在 平板上预培养 后，用涂布棒轻轻刮下分生孢子，置于加钢珠的 离心管中，涡旋，制成分生孢子悬浮液，血球计数板计数，调整终浓度 个。移液器吸取 分生孢子悬浮液，分别均匀涂布至含、咪鲜胺的 平板，预培养 后，紫外灯垂直距离 照射、，立即置于黑暗条件下，培养 后，观察病菌生长情况。紫外照射处理后能正常生长的菌株转入无药 平板继续培养，记为第 代，测其。以菌株 与敏感性基线的比值计算抗性倍数（，），测定药剂驯化与紫外诱导所得菌株的抗性水平，统计抗性菌株数量。为敏感（），为低抗（），为中抗（），为高抗（）。按.项方法测定灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性，根据 判定菌株抗药性，筛选不同抗性的突变体。抗性倍数（）菌株 敏感基线.抗药稳定性参考范昆等的方法，将抗性突变体在无药 平板上活化，能正常生长的菌株继续在无药 平板上连续转接至 代，恒温培养 ，每个菌株设 次重复，采用菌丝生长速率法测定、代的，参照.项方法划分抗性水平，观察抗性突变体的稳定性。.突变体适合度.菌丝生长速率测定 参考张嘉怡等的方法，将已活化的抗性突变菌株及其敏感亲本菌株接种于 平板中央，恒温培养 ，期间每隔 用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设 次重复。.产孢能力测定参考金宇杰等的方法，在 活化 的菌落边缘打取直径 菌饼，转接至 平板（直径 ）中央，恒温培养 后，每皿加入 ，用涂布棒将所有菌丝刮下，转至含无菌钢珠的 离心管，涡旋振荡，再用无菌纱布过滤得分生孢子悬浮液，孢子浓度用血球板计数，计算单位面积内菌株产孢量，每个菌株 次重复。.致病性测定参考张嘉怡等的方法，采用离体叶片法，选取新鲜、健康的人参叶片，用无菌水冲洗干净后，于 乙醇中浸泡 表面消毒，再用无菌水冲洗 次，取出晾干，放入无菌培养皿。突变体及对应亲本在 平板上活化培养 后，用接种针打取直径 菌饼，接种到同一叶片对称两侧，每个处理 次重复，只接种 培养基的叶片作为空白对照，黑暗培养 后观察叶片发病情况，十字交叉法测量病斑直径。.交互抗性测定采用菌丝生长速率法测定人参灰霉病菌咪鲜胺抗性菌株对啶酰菌胺、嘧霉胺和异菌脲的敏感性。供试菌株在 平板上 培养 后，在菌落边缘取直径 菌饼，转至含系列浓度的 含药平板。各杀菌剂处理浓度设置为：啶酰菌胺、；吡唑醚菌酯、；异菌脲、.、.、；嘧霉胺、，每个处理重复 次。将菌株对不同杀菌剂的 对数值用.软件做 相关性分析，根据 相关系数 和 确定杀菌剂间是否存在交互抗性。当.且.时，说明人参灰霉菌对 种杀菌剂存在交互抗性。乐默怡等：人参灰霉病菌对咪鲜胺敏感性基线的建立及抗药性风险评估 结果.灰霉病菌对咪鲜胺的敏感基线 株供试人参灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性频率分布见图。菌株对咪鲜胺的敏感性频率分布呈连续变化，为.，均值.。正态检验结果表明，供试菌株对咪鲜胺的敏感性频率不符合正态性分布（.）。根据正态性检验结果，取 前 株作图，其敏感型频率分布符合正态分布（.），满足敏感性基线建立的要求，可将该部分菌株对咪鲜胺的均值（.）作为灰霉病菌对咪鲜胺的敏感基线，用于人参灰霉病菌的田间抗药性监测。图 人参灰霉病菌对咪鲜胺的敏感性分布频率.抗药突变体的获得及抗性水平药剂驯化共获得 株在含 咪鲜胺的 平板及无药平板上均能稳定生长的菌株，分别标记为、和。紫外诱导孢子获得 株经 紫外照射后在含 咪鲜胺的 平板及无药平板上均能生长的菌株，标记为。紫外诱导菌株得到 株经 紫外照射后在含 咪鲜胺 平板及无药平板上均能生长的菌株，分别标记为、和。紫外诱导菌株获得 株经 紫外灯照射在含 咪鲜胺 平板及无药平板上均能生长的菌株，标记为。将上述诱导获得的 株灰霉病菌标记为 代，根据.项建立的敏感基线，株划分为敏感型菌株，株划分为抗性菌株，包括 株中抗（）和 株 低 抗（、和），见表。.抗药突变体的遗传稳定性 株抗性突变体中，、在 平板上培养，代出现生长抑制，无法稳定生长；和 的 代较 代对咪鲜胺的敏感性增强，和 的 代较 代对咪鲜胺的敏感性减弱，但抗性水平无明显变化，见表。表 人参灰霉病菌抗性突变体对咪鲜胺的抗性水平 抗性突变体毒力回归方程相关系数（）抗性倍数（）抗性水平.注：、分别表示紫外线诱导菌饼、紫外线诱导菌饼、紫外线诱导孢子和药剂驯化得到的抗性突变体（表、同）；、分别表示对杀菌剂敏感、低抗和中抗。.抗药突变体的适合度 平板培养、后，抗性突变体、和 菌落直径均显著低于亲本、（.）。抗药突变体 的产孢量显著低于亲本（.），其余 株抗性突变体产孢量均低于亲本，但差异不显著。除突变体 致病力显著高于 亲 本 外（.），突 变 体 和致病力均显著低于亲本（.和.），见表。年 月第 卷第 期.，.，表 人参灰霉病菌咪鲜胺抗性菌株及无药培养后代对咪鲜胺的抗性水平 抗性突变体对亲本菌株的 对继代培养抗性菌株的 第 代第 代第 代第 代.表 人参灰霉病菌咪鲜胺抗性突变体及其亲本的适合度 抗性突变体菌落直径 产孢量 个 病斑直径.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）.）注：与亲本菌株相比）.，）.。.交互抗药性抗性突变体、和对啶酰菌胺敏感，对吡唑醚菌酯、异菌脲、嘧霉胺表现抗性。咪鲜胺与啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、异菌脲和嘧霉胺在 检验下的显著水平 分别为.、.、.、.，说明咪鲜胺与上述杀菌剂无明显交互抗性，见图。讨论与分析灰霉病不仅是全球农作物及设施蔬菜上的重要病害，对人参等药用植物危害也相当严重。尽管灰霉病生物防治手段近年屡有报道，但从防治效果及稳定性考虑，目前农业生产上灰霉病防控仍主要依赖多菌灵、腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺等杀菌剂。课题组前期研究发现，人参灰霉病菌对多种灰霉病杀菌剂已产生不同程度的抗药性。因此，人参灰霉病防控迫切需要新型可替代杀菌剂，以防止灰霉病流行造成重大经济损失。咪鲜胺作为新型咪唑类杀菌剂，能抑制子囊菌及半知菌麦角甾醇生物合成，进而表现抑菌作用。本研究发现，我国人参主产区 株供试灰霉菌株均对咪鲜胺敏感，说明该杀菌剂用于人参灰霉病防治的潜力较大。抗性风险评估结果显示，人工诱导抗性突变体继代培养不能稳定生长或多代培养后出现抗药性降低；全部抗性突变体的菌丝生长速率及产孢量均不及亲本，多数突变体致病力也低于亲本。综上研判，人参灰霉病菌群体中咪鲜胺抗性菌株形成优势群体，进而导致灰霉病防效丧失的风险较低。研究还发现，咪鲜胺与常用灰霉病杀菌剂啶酰菌胺、吡唑醚菌酯、异菌脲及嘧霉胺无明显交互抗性。因此，将咪鲜胺与上述杀菌剂混合或交替施用，不仅可以提高人参灰霉病防控效果，还有助于延缓人参灰霉病菌抗药性的产生。本研究人参灰霉病菌对咪鲜胺敏感基线的建立，可为灰霉病菌群体抗药性监测提供帮助。另外，应深入研究咪鲜胺的人参灰霉病防控效果、残留动态，及其对人参生长、有效乐默怡等：