缺糖缺氧_再灌注对星形胶质...泌体miRNAs表达的影响_韩韦华.pdf

论著缺糖缺氧 再灌注对星形胶质细胞外泌体 表达的影响韩韦华，黄庭睿，文田甜，沈耀温州医科大学检验医学院（生命科学学院）检验医学教育部重点实验室，浙江温州 摘要：目的探讨缺糖缺氧再灌注（）对星形胶质细胞外泌体中微小（）表达的影响。方法对新生原代培养的 大鼠大脑皮层星形胶质细胞进行缺糖缺氧（）或 处理，采用超高速离心法分别收集培养基上清液和细胞内的外泌体。通过透射电镜和流式细胞术鉴定外泌体。采用 测序平台检测外泌体 的表达谱，从中选取表达受 及 处理影响的 。并用实时荧光定量聚合酶链反应（）对生物信息学分析中差异有统计学意义的 进行实验验证。使用 和 预测高表达 的靶基因，再将挑选出的共同靶基因在 中进行 富集分析。采用 （）检测 及其星形胶质细胞外泌体对全反式维甲酸（）诱导分化的 细胞 磷酸化水平的影响。结果与对照组相比，处理改变了星形胶质细胞外泌体 的表达谱；而再灌注 后改变的 大部分恢复到对照组水平。验证显示：种 在外泌体中的分布水平远高于细胞，而且这种富集作用可能不受 刺激的影响。富集分析显示：表达上调 的靶基因信号通路主要为代谢通路，包括 、和信号通路等。、及正常星形胶质细胞外泌体处理均能上调相应培养条件下 细胞的 和 水平。结论 处理能显著影响星形胶质细胞外泌体 的表达，其外泌体中富集分布的 均靶向作用于代谢通路，如 、和 等信号通路。关键词：星形胶质细胞；外泌体；缺糖缺氧再灌注 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：，（），：（）（），（），（）（），国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，基金项目：浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）项目（）；浙江省自然科学基金项目（）。作者简介：韩韦华，女，在读硕士研究生，主要从事检验医学方面的研究。网络首发 ：（），：；星形胶质细胞是脑组织内数量最多的一类细胞，其通过大量突起或递质的分泌与脑内其他细胞建立密切的信息联系，在正常生理及病理过程中扮演着重要角色。外泌体是一种直径为 的囊性小泡，是已发现的众多细胞外微粒体的一种，可由机体多种细胞分泌。外泌体中具有相当数量的微小（）、信使 （）、蛋白质，甚至还包括线粒体，并通过依赖于膜表面信号分子，膜融合后的内容物释放，以及信号分子的胞外释放等途径在细胞间信息的传递中发挥重要作用。外泌体在多种疾病中发挥着重要调节作用，如间充质基质细胞（）可通过分泌外泌体在心脑血管等疾病的治疗中发挥作用，而这种作用又受外泌体的来源细胞和靶细胞所处的环境和状态影响。脑组织内的星形胶质细胞也可分泌外泌体，而且对星形胶质细胞做不同的处理就会刺激其释放出具有不同生物学作用的外泌体。细胞分泌的 通过外泌体的运输可传送到另一个细胞，而 通过靶向降解 或抑制 的翻译参与个体的发育、细胞分化、增殖、凋亡等生理调控过程 。目前，外泌体 调控作用成为细胞与细胞之间信息传递研究的热点。然而，星形胶质细胞源性外泌体 分泌水平在脑缺血过程中的变化及其在缺血损伤及修复中所发挥的作用尚不清楚。因此，本研究利用新一代高通量 测序技术对星形胶质细胞源性外泌体 进行生物信息学分析，探讨缺糖缺氧（）和缺糖缺氧再灌注（）对星形胶质细胞外泌体 表达谱的影响。材料与方法材料新生 内 级的 （）大鼠由温州医科大学动物实验中心提供。胰酶细胞消化液、多聚赖氨酸溶液、蛋白浓度检测试剂盒和青霉素链霉素溶液购自碧云天生物技术有限公司。高糖、无糖 培养液及去外泌体血清购自 公司。胎牛血清为 公司产品。全反式维甲酸诱导（）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。抗 兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 （稀释使用）购自杭州戴格生物技术有限公司。抗细胞外信号调节激酶（）、抗 和抗 、抗 兔单克隆抗体（稀释使用）购自 公司。试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。实时荧光定量聚合酶链反应（）检测试剂：、均购自诺唯赞生物科技有限公司。方法细胞培养参考文献 的方法进行细胞培养。采用 内新生 大鼠的大脑皮层，用手术刀片切碎，再用 胰酶消化 。而后用玻璃滴管吹打细胞团块直到未见明显絮状组织后停止吹打而获得细胞悬液。将细胞种植于预先用多聚赖氨酸溶液包被的密闭细胞培养瓶中。培养 左右，细胞长满整个瓶底，将其固定在 恒温摇床中，以 速率振荡摇晃 左右，以去除小胶质等杂细胞而使星形胶质细胞纯化。细胞（源于人神经母细胞瘤细胞）培养于培养液，待生长到 时去掉旧的培养基，用 洗涤细胞次，而后培养于含胎牛血清（）的培养基。在避光条件下，加入 溶液，使其终浓度为 ，处理。细胞 模型的构建待星形胶质细胞长满后，用 洗涤次，加入无糖溶液，再将细胞置于缺氧罐内（、，）处理（作为 组）。待 处理结束后去除无糖 并换成正常含糖 培养基，并置于 恒温 培养箱内培养，作为 或 组。星形胶质细胞外泌体提取用去外泌体血清培养星形胶质细胞 后收集培养基上清液，然后用超速离心法收集外泌体。分别收集星形胶质细胞在不同条件下处理后的培养上清液。以 离心 后提高转速到 离心 。去除沉淀收集上清液，以 离心 后用 注射滤器过滤，以 离心 。收集的沉淀用 重悬，继续以 离心 ，弃净上层 重悬液后加入 后吹打沉淀，收集到预冷过的 管内，保存。透射电镜法鉴定外泌体样品固定在的戊二醛溶液内，置于 过夜；倒掉固定液后用 ，值为的磷酸盐缓冲液漂洗样品次，每次 。再用的锇酸溶液固定样品，后用磷酸盐缓冲液漂洗。设置乙醇溶液浓度梯度（包国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，括、和 这种浓度）对样品进行脱水处理，每种浓度处理 ，再用 的乙醇处理 ；最后过度到纯丙酮中处理 。用 包埋剂与丙酮的混合液（体积比为）处理样品；用 包埋剂与丙酮的混合液（体积比为）处理样品；纯包埋剂处理样品过夜；将样品经过渗透处理后包埋置于 加热过夜，即得到包埋好的样品。利用莱卡 型超薄切片机将包埋样品切成 的切片，柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀 乙醇饱和溶液对切片各染色 ，即可在日立 型透射电镜中观察。外泌体流式细胞仪表面标记物检测使用流式细胞术进行外泌体表面标记物 和 的检测。经超速离心法收集分离得到的星形胶质细胞源性外泌体沉淀，用 已经过滤的 复匀外泌体。用不染色的外泌体作为阴性对照；将收集到的外泌体分别进行 和 两组抗体染色，标记为 和 。按照仪器操作规程上机检测（由广州市锐博生物科技有限公司完成）。外泌体 高通量测序标本提取总 后，首先使用 连接酶将一个腺苷化单链 接头和 接头相继连接到 上，其中 端接头的端为 ，端有氨基保护，所以能够减少 的自连。端接头被设计成可以捕获带有 磷酸基团的 。带有 与 链接接头的 序列，通过与端互补的反转录引物进行反转录反应，最后对反转录产生的 序列进行 扩增。最后，对 长度范围的 产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行胶回收，从而完成整个文库的制备工作，对构建好的文库使用 进行测序，测序读长为单端 （由杭州联川生物技术股份有限公司完成）。验证检测细胞内及外泌体内 家族种 。使用 试剂提取细胞内及外泌体内总 。使用 试剂盒（茎环法）从总 合成 ，然 后 采 用 进 行 ，以 作 内 参 对 照。相 对 表达水平采用 方法进行计算。引物序列如 下，反 转 录 引 物：；引 物，正 向：；引物，正向：；引物，正向：；引 物，反 向：；引 物，正 向：，反 向：。（）检测 磷酸化水平 细胞经 及外泌体处理后收集细胞并提取蛋白质，参考文献 ，采用 测定 总蛋白表达水平及磷酸化水平，以 作为内参。统计学处理采用 软件进行数据分析。使用 软件作图。计量资料以表示，组间比较采用独立样本检验。为差异有统计学意义。结果星形胶质细胞外泌体的鉴定利用透射电镜观察外泌体的立体结构，显示 的双膜结合小泡。使用流式细胞术检测外泌体表面标记物 和 的表达，均呈阳性，分别为 和。原始数据的筛选分析在本研究缺糖缺氧再灌注组（）与正常对照组的总共组标本中，经过高通量 测序，共获得了原始数据（）（对照组），（组），（）。经过数据筛选后，所获取的有效数据量在各组相应的数据总量中占比分别 达 到 了 （对 照 组），（组），（组）。数据的质与量满足进一步的深度生物信息学分析质控要求。及 对星形胶质细胞外泌体 表达谱的影响 处理，使外泌体中 、表达显著下调（），而 家族成员，如 、和 ，以及 和 表达显著上调（，差异倍数，）。再灌注 处理后，家族成员表达开始下调，恢复至与对照组比较差异无统计学意义的水平（），处理导致的表达下调的 也恢复至和对照组比较差异无统计学意义的水平（）。组与对照组比较，在同时满足，差异倍数，的条件下，只有 的表达差异有统计学意义（）。见表、。表 组和对照组的比较 对照组 组差异倍数 国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，续表 组和对照组的比较 对照组 组差异倍数 注：表 示 某 个 标 本 的 所 有 总 和（以 百 万 为单位）。表 和 组的比较 组 组差异倍数 注：表 示 某 个 标 本 的 所 有 总 和（以 百 万 为单位）。验证为了进一步验证 表达水平的变化。本 研究从 中 差 异 有 统 计 学 意 义 的 中选择了 家族成员 、进 行 验 证。结 果 发 现，这 种 在外泌体中的分布水平远高于细胞（），即 、和 主要富集在外泌体中，而这种富集作用不受 刺激的影响。此外，组外泌体中 表达水平高于对照组外泌体中的表达水平（），而 和 的表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（）。见图。注：与对照组比较，；表示对照组外泌体；表示 组外泌体。图 的 验证 富集分析从对照组、组和 组中分别挑选出高表达的 （高于平均值），用 和 预测靶基因，挑选出共同的靶基因在 中进行 富集分析。组中，外泌体高表达 的靶基因所涉及的信号通路主要为代谢相关通路，如 、和信号 通路。组 中 外 泌 体 富集的信号通路基本相同，组中富集分析排列在第位到第位的信号通路全部相同；而在富集到的前 条信号通路中只有两条信号通路有所差别；组间存在少许差异，如 组中没有富集到 信号通路，组中没有富集到 信号通路。星形胶质细胞外泌体和 处理对 细胞 信号通路的影响为了进一步验证外泌体和 处理对中分析得到的信号通路的影响，选择了 信号通路实验验证。分别提取了星形胶质细胞对照组、组、组、组、组分泌的外泌体，分别作用于相同处理的 细胞，然后提取细胞总蛋白，对 、蛋白和 、蛋白表达进行测定。和 处理使 细胞 水平下调（），而给予 和的星形胶质细胞外泌体则能逆转 和诱导的 细胞 水平的下调（）。和 处理促使 细胞 水平下调（），而给予 和 处理的星形胶质细胞外泌体则能逆转 和 诱导的 细胞 水平的下调（）。此外，给予正常状态星形胶质细胞分泌的外泌体进行处理也能显著上调正常条件下培养的 细胞的 、水平（）。见图。国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，注：表示对照；表示外泌体；与对照比较，；与 或 处理组比较，；、分别表示对细胞进行 、处理；、分别表示对细胞进行 、处理。图、及星形胶质细胞外泌体处理对 细胞 信号通路的影响讨论星形胶质细胞在缺血性脑卒中的发生、发展及后期的恢复过程中均发挥重要的调节作用。脑缺血后，在受影响脑区的星形胶质细胞是最早对缺血作出反应的细胞，形成反应性星形胶质细胞，通过大量突起、分泌胶质细胞来源递质及外泌体等与脑内其他细胞建立密切的信息联系 。有文献报道，对星形胶质细胞做不同的处理会刺激细胞释放出具有不同生物学作用的外泌体。如使用淀粉样蛋白作用于小鼠大脑皮层星形胶质细胞，会引起星形胶质细胞分泌富含神经酰胺和前列腺凋亡反应蛋白的外泌体，这些外泌体可作用于星形胶质细胞自身及其周围神经元，促进星形胶质细胞和神经元的凋亡。而热应激则引起星形胶质细胞释放含有大量 的外泌体，该外泌体可能对星形胶质细胞周围神经元的存活起关键作用。不同程度的 处理会造成不同程度的星形胶质细胞 损伤，也 可能导致星形 胶 质 细 胞 增 殖 。处理不同时间导致的星形胶质细胞状态改变也对神经元产生保护或损伤的不同作用。这可能与不同时间 处理会促使星形胶质细胞递质、外泌体等释放的改变有关。在研究采用 处理星形胶质细胞后，其外泌体 表达谱发生了明显改变