清润一号方对慢传输型便秘大鼠的作用及机制_秦婷婷.pdf

8苏萍，王蕾，杜仕静，等.三七皂苷对神经系统疾病药理作用机制研究进展 J 中国中药杂志，2014;39(23):4516-21.9刘大会，徐娜，郭兰萍，等.三七药材质量特征和商品规格等级标准研究 J 中国中药杂志，2016;41(5):776-85.10倪慧姝，付立波，马铭阳，等.三七参与炎症痛大鼠痛觉调节作用 J 江苏农业科学，2019;47(17):180-2.11付立波，付立山，张静菊，等.丹参对家兔离体小肠平滑肌生理特性的影响J 长春师范学院学报(自然科学版)，2009;28(6):35-9.12张莉，韩力辉.穴位敷贴联合放血治疗寒湿性腰肌劳损 40 例疗效观察 J 中国民族民间医药，2018;27(11):118-20.13张湘杰，何永恒.花椒、延胡索、没药、三七镇痛的药理学研究概述 J 海峡药学，2009;21(2):62-3.14魏武，温迪，顾柯.阿片类药物在慢性疼痛治疗中的应用 J 中国医刊，2012;47(11):11-7.15车璐，裴丽坚，黄宇光.阿片类药物临床应用进展 J 广东医学，2015;36(21):3264-6.16耿刚，贾立群，贾英杰，等.阿片类药物不良反应中医诊疗专家共识 J 中国肿瘤临床，2019;46(7):321-3.17孙军红.丹参药理活性成分的整合效应J 中国医药指南，2014;12(9):188.18王炜辰，吴学辉，郑芳.丹参药理学研究进展 J 海峡学，2013;25(10):24-5.19付立波，张文平，杨燕平，等.北五味子对正常大鼠痛觉的调节作用 J 中国老年学杂志，2016;36(7):3110-1.20杨胜男，李莹，赵玉菲，等.当归对正常和神经痛大鼠镇痛作用的比较研究 J 黑龙江畜牧兽医，2015;(4):114-5.21付立波，周强，赵瑛伟，等.川木通对老年大鼠痛觉的调节作用J 黑龙江畜牧兽医，2019;(8):139-41.22付立波.侧脑室注射淫羊藿苷对正常大鼠痛觉调节的影响 J 中国老年学杂志，2012;32(13):2775-6.2021-10-27 修回(编辑王一涵)清润一号方对慢传输型便秘大鼠的作用及机制秦婷婷车瑾曹蔚韩慧敏刘扬程慧妤夏俊徐洋(武汉市第三医院肿瘤科，湖北武汉430060)摘要 目的探讨清润一号方对慢传输型便秘大鼠的影响及其作用机制。方法15 只 SD 大鼠，按随机数字表法分为对照组、模型组和清润一号方组各 5 只，清润一号方组实验前用酒精棉球消毒后在腹壁贴穴位敷贴，每贴内含生药约 5 g，每 24 h 更换 1 次，共 3 d，模型组给予洛哌丁胺灌胃构建慢传输型便秘大鼠模型，检测大鼠粪便数量和含水率，活性炭推进实验检测肠道传输功能，免疫组化观察 Cajal 间质细胞(ICC)阳性细胞数量，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清血管活性肠肽(VIP)、神经降压素(NT)和结肠胃动素(MTL)和 P 物质(SP)的含量。结果与对照组相比，模型组造模 5 d 后粪便含水率、活性炭推进率、ICC 阳性细胞数和神经递质 VIP、NT、MTL 和 SP 含量显著降低(P0.05);与模型组相比，清润一号方组治疗8 d后粪便含水率、治疗 9 d 后粪便数量、活性炭推进率、ICC 阳性细胞数和神经递质 VIP、NT、MTL 和 SP 含量显著增加(P0.05)。结论清润一号方能一定程度上缓解便秘，其作用机制可能与改善 ICC 功能和调节神经递质有关。关键词 清润一号方;慢传输型便秘;Cajal 间质细胞;神经递质中图分类号 332;331 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0667-04;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.041基金项目:武汉市卫生计生委科研计划资助项目(WZ18Z02)通信作者:徐洋(1977-)，男，主治医师，主要从事恶性肿瘤诊治研究。第一作者:秦婷婷(1982-)，女，主治医师，硕士，主要从事恶性肿瘤研究。慢性传输型便秘(STC)定义为结肠蠕动和粪便频率降低，通常伴有腹胀，是一种常见的胃肠道疾病，其不仅严重影响生活质量，而且给患者造成了一定的经济负担1，2。近年来，STC 患病率不断增加，但其发病机制仍不清楚，使其成为临床治疗的难题。目前，用于治疗 STC 的药物是泻药和催化药物，刺激性泻药的使用效果显著，但不良反应明显，并且容易形成药物依赖性3。中医药治疗具有安全性高，疗效显著的优势。贴敷疗法是中医药治疗的一种，是将中药磨成细粉或做成膏剂，贴敷于穴位或者患处的治疗方式。研究表明4，5，穴位贴敷疗法可使中药通过穴位皮肤吸收，刺激穴位调节脏腑气血，达到治疗作用。临床研究6发现，清润一号方敷贴可缓解 STC 患者的便秘情况，本研究通过建立 STC 大鼠模型，探讨清润一号方中药敷贴方剂对 STC 大鼠的影响及其作用机制。1材料与方法1.1实验动物清洁 SD 成年雄大鼠 15 只，体重(20010)g，动物来源于三峡大学，实验动物生产许可证:SCXK(鄂)2017-0012，使用许可证，:SYXK(鄂)2018-0104。室内温度 18 27，湿度 45%65%，正常喂食水，适应性喂养 1 w 后开始造模。766秦婷婷等清润一号方对慢传输型便秘大鼠的作用及机制第 3 期1.2药物清润一号方6:50 g 大黄(批号:20181201)，20 g 玄明(批号:20181201)，20 g 茴香(批号:20181001)，10 g 泽泻(批号:20190404)，10 g玄参(批号:20190301)，10 g 黄芪(批号:20180401)均购自湖北天济中药饮片有限公司;60 g 医用凡士林隔水加热溶解成液状，按 1 2的终比例依次加入中药精细粉，混匀成膏状，冷却后备用。准备相应大小穴位贴，大小为 3 cm4 cm，其中给药区直径约1.5 cm。取调制好的膏剂 5 g，涂于穴位贴中，制成直径 1.5 cm，厚约 0.5 cm 的药膏。1.3试剂与仪器主要试剂:大鼠血管活性肠肽(VIP)、神经降压素(NT)、胃动素(MTL)、P 物质(SP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Bio-swamp，中国);TritonX-100(北京索莱宝科技有限公司，中国);甲醛，二甲苯，无水乙醇，30%H2O2，粉末活性炭(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，中国)。主要仪器:酶标仪(Ladsystems，芬兰)，离心机(湖南平凡科技有限公司，中国)，显微镜(Leica 公司，德国);冷冻切片机(湖北徕克医疗仪器有限公司，中国)。1.4STC 大鼠模型的构建及鉴定造模组均每日给予洛哌丁胺混悬液 10 ml(2 mg/kg，分别于每日9 00，17 00 给药，每次 5 ml)灌胃，共 7 d。大鼠摄食量明显减少，粪便排出数量及质量显著降低，即建模成功。1.5实验分组及处理将 15 只 SD 大鼠分为对照组、模型组和中药贴敷组各 5 只。模型组:每日给予洛哌丁胺混悬液 10 ml(2 mg/kg，分别于每日 9 00，17 00)灌胃，共 7 d。中药贴敷组:造模成功后贴敷中药，给药前 1 d 给大鼠腹部脱毛，面积约为 5 cm5 cm，酒精棉球消毒后在腹壁贴穴位敷贴，每贴内约含生药 5 g，每 24 h 更换 1 次，共 3 d。造模成功后，自贴敷给药第 1 天起，每日记录粪便数量(粒)和质量(干重和湿重)。1.6粪便数量及含水率检测记录给药后所有大鼠的首次排便时间，收集大鼠粪便，记录排便数量，测定粪便干、湿重，计算粪便含水率(%)=粪便湿重粪便干重/粪便湿重100%。1.7活性炭推进实验检测肠道传输功能用活性炭 10 g 加蒸馏水 100 ml 制成 10%炭末混悬液，所有大鼠用10 ml 10%活性炭混悬液灌胃，并于2 h 后颈椎脱臼处死，立即剖腹摘除从幽门至直肠末端的全部肠道，进行指标观察及测算。将摘除的全部肠道置于托盘中，在松弛状态下测量肠道的全长及活性炭混悬液在肠道内推进的长度，并计算活性炭混悬液推进长度与肠道全长的百分比。炭末推进百分率(%)=炭末前端与幽门的距离/肠道全长100%。1.8Cajal 间质细胞(ICC)形态学观察将所有肠道置于冰冻切片机中，用 OCT 包埋剂包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色。每张切片染色阳性区域随机选择 5 个高倍镜视野(200)观察，并选择结肠区域环肌层在 400 倍光学显微镜下数阳性细胞个数，以每个高倍镜视野下阳性细胞个数的平均值做统计学分析。1.9ELISA 检测血清 VIP、NT、MTL 和 SP 的含量给药结束后，从大鼠腹腔抽取 5 ml 血液，37 静置30 min，待血液凝结后，3 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液，放置80冰箱保存，采用 ELISA 分别检测 VIP、NT、MTL 和 SP 含量，严格按照说明书上操作。1.10统计学处理采用 SPSS23.0 软件进行 t 检验，使用 Graph Pad Prism5 软件进行数据作图。2结果2.1清润一号方对 STC 大鼠粪便数量及含水率的影响与对照组比较，模型组在第 5 天起粪便数量和含水率明显减少(P0.05)。提示便秘模型构建成功。与模型组相比，清润一号方组进行敷贴治疗第 8 天起，粪便含水率显著增加，第 9 天起粪便数量显著增加(P0.05)。见表 1、表 2。表 1各组粪便数量的变化(xs，n=5，粒)组别1 d2 d3 d4 d5 d对照组23.2011.8237.207.8937.807.9836.4011.8938.802.95模型组15.407.7720.605.981)23.2014.4826.804.4423.404.281)清润一号方组11.607.4014.608.9121.607.9623.406.1126.8010.28组别6 d7 d8 d9 d10 d对照组38.005.8738.605.4639.004.9532.202.7735.404.160模型组18.804.211)16.605.861)18.006.961)18.605.371)16.804.661)清润一号方组18.406.8818.803.1124.402.0734.009.622)35.408.762)与对照组比较:1)P0.05;与模型组比较:2)P0.05;下表同866中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷表 2各组粪便含水率的变化(xs，%，n=5)组别1 d2 d3 d4 d5 d对照组51.009.6054.995.7248.014.0850.096.0449.076.21模型组45.431.5041.996.911)38.166.021)43.525.7036.373.971)清润一号方组41.383.7947.818.9443.634.2534.397.0941.977.47组别6 d7 d8 d9 d10 d对照组53.897.1255.469.3763.863.8453.873.9458.633.45模型组32.774.971)26.578.041)17.195.121)20.197.821)21.215.601)清润一号方组33.827.8324.157.4429.045.002)48.335.162)48.447.032)2.2清润一号方对 STC 大鼠结肠传输功能的影响与对照组(97.370.60)%相比，模型组活性炭推进率(92.830.15)%显著降低(P0.05);与模型组相比，清润一号方组活性炭推进率(96.670.40)%显著升高(P0.05)。2.3清润一号方对 STC 大鼠结肠 ICC 的影响大鼠结肠 ICC 形态观察和阳性细胞数量变化:每张切片在 400 倍显微镜下观察，并计算阳性细胞个数，各组免疫组化结果表明，模型组 ICC 阳性细胞数(2.561.81)个 较对照组(13.672.00)个 明显减少，清润一号方组(6.781.86)个 较模型组阳性细胞数显著增加(均 P0.05)。见图 1。图 1