轻度认知障碍患者血浆中差异...croRNA生物信息学分析_刘艳.pdf

轻度认知障碍患者血浆中差异表达 microNA 生物信息学分析刘艳于明徐宇浩(江苏大学附属医院神经内科，江苏镇江212001)摘要 目的应用生物信息学方法分析轻度认知障碍(MCI)患者血浆中差异表达 microNA。方法从美国国立生物技术信息中心(NCBI)公共数据平台的 GEO 数据库检索并筛选 MCI 相关基因芯片数据集，使用 GEO2 在线分析工具筛选差异表达的 microNA;利用 TargetScan7.2 在线预测工具预测差异表达 microNA 的靶基因，并通过 String 数据库构建编码蛋白相互作用(PPI)网络及利用 Cytoscape 的 CytoHubba 插件筛选关键基因(Hube gene);利用 Cytoscape3.7.2 软件构建差异表达microNA 的 microNA-靶基因相互作用网络，筛选关键 microNA;运用 语言分析包对差异表达 microNA 的靶基因进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。结果筛选出 14 个显著下调的 microNAs，通过在线工具预测14 个 microNA 的靶基因并构建 PPI 和 microNA-靶基因的相互作用网络，结果显示 hsa-mi-27b、hsa-mi-146a、hsa-mi-23a 和 has-mi-93*是核心网络中的关键 microNA。GO 富集分析结果显示，关键 microNA 主要参与轴突生成、化学突触传递的调控、跨突触信号的调节、信号释放及糖蛋白代谢等生物学过程。而 KEGG 通路富集分析结果显示，它们主要参与调控 MAPK 信号通路、as 信号通路、Hippo 信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTO)信号通路、轴突导向及糖胺聚糖的生物合成等信号通路。结论hsa-mi-27b、hsa-mi-146a、hsa-mi-23a 和 has-mi-93*是 MCI 患者血浆中关键的 microNAs，可能成为诊断 MCI 进展至阿尔茨海默病(AD)的候选生物标志物。关键词 轻度认知障碍;阿尔茨海默病;microNA(miNA);生物标志物中图分类号 749.16 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0572-06;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.018基金项目:2019 年镇江市重点研发计划(SH2019036)通信作者:于明(1972-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事痴呆与帕金森病的基础与临床研究。第一作者:刘艳(1996-)，女，硕士，住院医师，主要从事阿尔茨海默病的基础与临床研究。轻度认知障碍(MCI)是介于正常老化和痴呆之间的临界状态1。研究表明 60 岁以上的成年人中MCI 患病率为 6.7%25.2%，其患病率的增加与年龄的增长及低教育水平高度相关，以男性更为常见2。据估计，每年有 10%15%的 MCI 患者会发展为阿尔茨海默病(AD)3。若及早发现和识别MCI 阶段，并对其进行积极有效的干预治疗，可改善患者的认知功能，延缓 MCI 向 AD 转化。因此，探索MCI 早期诊断及预测疾病进展的生物标志物一直是研究者们关注的焦点。microNAs 是调节神经元和神经胶质细胞功能的关键因子4。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，生物液体中的 microNA 水平分析已经成为一种可行的生物标志物诊断方法。本研究应用生物信息学方法分析和筛选 MCI 患者血浆中关键的 microNAs，并对关键 microNA 的靶基因进行富集分析。1材料与方法1.1基因芯片数据来源在 NCBI(National centerfor biotechnology information)公共数据平台的 GEO(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)数据库搜索框中以“(mild cognitive impairment)AND microNA”为检索词，选择物种为人类(Homo sapiens)，下载GSE90828 基 因 芯 片 数 据 集 数 据(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE90828)。该数据集是基于 GPL22741 平台采用(Human PC panels+，V2)miCUY LNATMmicroNA 芯片(丹麦 Exiqon 公司)检测的 53 例血浆标本，包含来自日本 23 例 MCI 患者和 30 例认知功能正常的老年人的血浆标本。MCI 组样本来源于11 例男性和 12 例女性，平均年龄(72.786.80)岁;正常对照组样本来源于 12 例男性和 18 例女性，平均年龄(70.404.51)岁。1.2差异表达 microNA 的筛选和数据处理利用 GEO2 在 线 分 析 工 具(https:/www ncbinlm.nih.gov/geo/geo2r/)对 GSE90828 数据集进行差异表达 microNA 分析和筛选，利用 Benjamini-Hochberg 方法减少错误发现率。设定差异表达 mi-croNA 过滤条件为校正后的 P 值0.05 且|差异倍数(logFC)|1.0，其中 logFC1.0 为上调、logFC1.0 为下调。运用(3.6.3 版本)语言程序包绘制火山图和差异表达 microNA 热图。1.3差异表达 microNA 的靶基因预测采用 Tar-getScan7.2(http:/www.targetscan.org/vert_72/)在275中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷线预测工具预测差异表达 microNA 的靶基因5，即通过寻找与 microNA 种子序列相匹配的保守的8mer、7mer 和 6mer 位点来预测 microNA 的生物学靶点，选择物种为人，并以 Cumulative weighted con-text+score0.4 筛选靶基因，该分值越小则靶基因的置信度越高6。1.4蛋白质-蛋白质互作网络分析STING11.0(https:/string-db.org)是一个常用的蛋白质-蛋白质互作关系的数据库，共存储 5 090 个物种和2 460 万种蛋白质，拥有非常广泛和多样的基准数据来源7。通过对蛋白质-蛋白质相互作用的可靠性评分，以判定相互作用可靠性的大小。STING将低可靠性、中等可靠性、高可靠性和最高可靠性的分值分别设置为 0.15、0.40、0.70、0.90。本研究中构建编码蛋白相互作用网络(PPI)的筛选条件为中等可靠性的阈值(即 Confidence score=0.4)，然后利用 Cytoscape3.7.2 软件8将蛋白质-蛋白质相互作用网络进行可视化，通过 CytoHubba 插件，对网络中所有节点进行评分，采用最大集团中心度(MCC)算法，筛选前 10 个关键基因(Hub Genes)。1.5差异表达 microNA-靶基因相互作用网络构建和关键 microNA 筛选Cytoscape3.7.2 软件构建差异表达 microNA-靶基因相互作用网络，使差异表达 microNA 与靶基因的相互作用进行可视化，从而筛选相互作用网络中的关键 microNA。差异表达 microNA 靶基因的筛选阈值为 cumulativeweighted context+score0.4。利用 CytoNCA 插件度量网络中各节点的中心度(Centrality)值，选择点度中心性(DC)参数，删去 DC 值2 的节点，进而得到核心网络，依据 DC 值大小进行排序，筛选核心网络中的关键 microNA。1.6关键 microNA 靶基因的基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析GO 富集分析能够对各物种基因和蛋白质的功能进行规范性描述，按照生物过程、分子功能和细胞组成对基因进行注释和分类。KEGG 是 1 个整合了基因组、化学、健康、系统 4 大类信息的综合数据库，通过强大的图形功能直观可视化地展现信号途径及各分子间的关系。使用 语言对关键 micro-NA 的靶基因进行 GO 富集分析和 KEGG 通路分析。其中 GO 富集分析以 q 值 Cutoff(校正后的 P 值临界值)0.05 为筛选条件且显示前 10 个 GO 富集分析条目;KEGG 富集分析以 q 值 Cutoff0.05 为筛选条件且显示前 30 个通路信息。1.7统计学分析采用 SPSS22.0 软件进行独立样本 t 检验。2结果2.1血浆差异表达 microNA 筛选基于 MCI 组与正常对照组的 logFC 表达和校正后的 P 值筛选差异表达的 microNA。与正常对照组相比，MCI 组血浆中存在 14 个显著下调 microNAs。显著下调 mi-croNAs 的具体表达情况，见表 1、图 1、图 2。表 1MCI 组患者血浆中显著下调的 microNAsmiNA校正后 P 值原始 P 值t 值logFChsa-mi-339-3p0.000 4770.000 0084.8741.556hsa-mi-151-3p0.000 4770.000 0184.6471.327hsa-mi-27b0.001 0330.000 1044.1461.273hsa-mi-15b*0.000 4770.000 0224.5871.217hsa-mi-146a0.000 7700.000 0484.3701.196hsa-mi-374a0.002 4420.000 4323.7191.148hsa-mi-23a0.002 8530.000 6243.6041.148hsa-mi-93*0.002 5760.000 5233.6601.125hsa-mi-6520.003 5380.001 0093.4521.120hsa-mi-151-5p0.001 0330.000 1164.1161.084hsa-mi-2210.003 5380.001 0583.4361.077hsa-mi-199a-3p0.003 2100.000 8033.5251.070hsa-mi-374b0.003 5380.001 0913.4261.062hsa-mi-106a0.006 1130.002 1013.2101.012丰度较低以“*”表示灰点表示下调的 microNAs，黑点表示无差异的 microNAs图 1血浆显著下调 microNAs 的火山图2.2靶基因相互作用网络图构建及关键基因的筛选利用 STING 数据库构建的 PPI 网络图涵盖节点蛋白 1 022 个、边 3 301 条，平均节点值为 6.46，见图 3。利用 CytoHubba 插件，筛选出前 10 个关键基因，分别为泛素结合酶(UB)E2D1、转录延伸因(TCE)B1、视网膜母细胞瘤结合蛋白(BBP)6、泛375刘艳等轻度认知障碍患者血浆中差异表达 microNA 生物信息学分析第 3 期素蛋白连接酶 E32(UB2)、UBE2W、锚蛋白重复序列与 SOCS 盒蛋白(ASB)6、Cbl 原癌基因(CBL)B、环指蛋白(NF)7、F 盒蛋白(FBX)O10 和葡萄糖胺(GLMN)，它们是蛋白-蛋白相互作用网络中的关键基因。2.3差异表达 microNA-靶基因相互作用网络的构建和关键 microNA 的筛选构建差异表达 mi-croNA-靶基因相互作用网络，见图 4。利用 CytoN-CA 插件筛选网络中的关键 microNA，DC 值居于前4 位 的 microNAs 分 别 为 hsa-mi-27b、hsa-mi-146a、hsa-mi-23a 和 has-mi-93*，是调控网络中的关键 microNAs。2.4关键 microNA 靶基因的 GO 富集分析hsa-mi-27b 主要参与了神经元投射发育的调控、轴突生成、化学突触传递、跨突触信号的调节及额叶发育等生物学过程;hsa-