青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究_周大祥.pdf

39(1)141-148 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-07-15 基金项目：重庆市自然科学基金（cstc2016jcyjA0198）作者简介：周大祥，副教授，博士研究生，E-mail：；*通信作者，硕士，副教授，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.03.003 青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究 周大祥1,2，杨俊年1，陈 弘1，殷幼平2，熊 书3*（1.重庆三峡学院生物与食品工程学院，万州 404120；2.重庆大学生命科学学院/重庆市基因功能与调控重点实验室，重庆 400300；3.重庆三峡医药高等专科学校基础医学部，万州 404120）摘要摘要：不同温度下青枯雷尔氏菌表达谱 PPI 网络分析发现，yqhE 可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因。克隆青枯雷尔氏菌 CBM613 的 yqhE 基因，结果发现该基因长度为 831 bp，共编码 276 个氨基酸。基因敲除结果显示，28 培养的 yqhE 突变株较野生型菌株致病力降低，病程延长，但并未彻底丧失致病力。20 和 28 培养的 yqhE 突变株维生素 C 的生物合成皆被抑制；与 28 相比，20 培养下野生型菌株维生素 C 的合成能力降低。突变株在 20 和 28 培养下甲基乙二醛（MG）和丙二醛（MDA）明显积累，其中 20 积累更多；20 培养的野生型菌株 MG 和 MDA 比 28 积累更多。维生素 C 的生物合成被抑制导致青枯雷尔氏菌自由基清除能力减弱与氧化应激反应增强，MG 和 MDA 积累产生细胞毒性，上述结果可能与 28 培养的突变株致病力减弱，20 培养的野生型菌株致病力丧失有关。综上结果表明 yqhE是青枯雷尔氏菌温度相关致病基因。关 键 词：青枯雷尔氏菌；温度相关致病基因；yqhE；基因敲除；功能研究 中图分类号：S432.1 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0141-08 Functional Analysis of Temperature Related Pathogenic Gene yqhE in Ralstonia solanacearum ZHOU Daxiang1,2,YANG Junnian1,CHEN Hong1,YIN Youping2,XIONG Shu3*(1.College of Biology and Food Engineering,Chongqing Three Gorges University,Wanzhou 404120,China;2.College of Life Science,Chongqing University/Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation,Chongqing 400030,China;3.Department of Basic Medicine,Chongqing Three Gorges Medical College,Chongqing 404120,China)Abstract:The protein-protein interoperability(PPI)network analysis of the expression profiles of Ralstonia solanacearum at different temperatures showed that yqhE could be a new temperature related pathogenic gene of Ralstonia solanacearum.the gene yqhE was cloned from Ralstonia solanacearum strain CBM613.The results showed that gene yqhE was 831 bp in length,encoding 276 amino acids.Its function was further confirmed by gene knock-out.The results showed that the pathogenicity of the yqhE mutant cultured at 28 was decreased and the course of disease was prolonged compared with the wild-type strain.Vitamin C biosynthesis of yqhE mutant cultured at 20 and 28 were inhibited.The vitamin C biosynthesis ability of the wild-type strain cultured at 20 was reduced compared with 28.Methylglyoxal(MG)and malondialdehyde(MDA)of yqhE mutant significantly accumulated at 20 and 28.MG and MDA of the wild-type strain cultured at 20 accumulated more than at 28.The inhibition of vitamin C biosynthesis resulted in the weakening of radical scavenging ability and the enhancement of oxidative stress reaction in Ralstonia solanacearum.The accumulation of MG and MDA produced cytotoxicity.The above results could be related to the weakening of pathogenicity in yqhE mutant cultured at 28 and the loss of pathogenicity in wild-type strain cultured at 20.In conclusion,yqhE could be a temperature related pathogenic gene in Ralstonia solanacearum.142 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 Key words:Ralstonia solanacearum;temperature related pathogenic gene;yqhE;gene knock-out;functional analysis 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 作为一种农作物毁灭性的致病菌，可引起全球主要的经济作物如土豆、番茄、烟草、辣椒和香蕉等萎焉。青枯雷尔氏菌能够在潮湿的土壤或水体中存活数年，当遭遇易感寄主，青枯雷尔氏菌就会进入植物根部，在根部皮层定殖，然后入侵木质部导管，最终通过导管系统迅速扩展到植物地上部，在寄主体内大量增殖引起导管堵塞、功能紊乱，出现萎蔫症状1。青枯病的发生与温度关系密切2,3，前期试验发现，青枯雷尔氏菌 CBM613 用 NB 培养基 28 培养 10 h，根部接种法接种番茄，28 培养后可引起植株萎蔫，20 培养后番茄不发病。对不同温度 A 下（20 和 28）CBM613 菌株表达谱 PPI 网络预测发现，2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶基因（yqhE）可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因4。YqhE 属于醛酮还原酶（aldo-keto reductases，AKRs）家族成员之一，该家族催化 2,5-二酮-D-葡萄糖酸（2,5-DKG）、甲基乙二醛（MG）和乙二醛（GO）分别还原为 2-酮-L-古龙酸（2-KLG）、丙酮醇和乙酮醇，在维生素 C 的生物合成、MG 和 GO 等的解毒中发挥重要作用。维生素 C 作为一种抗氧化剂，能够防止脂膜过氧化，提高生物体对逆境的耐受。YqhE 是维生素 C 生物合成的关键酶，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在下能够催化 2,5-DKG 还原为2-KLG5,6。MG 和 GO 属于活性二羰基化合物7。它们与核酸及蛋白质互作，增加 DNA 突变频率，引起蛋白质功能异常8。YqhE 在 NAD（P）H 存在下可将 MG 还原为丙酮醇，进一步被甘油脱氢酶等转化为1,2-丙二醇解毒9。而 AKRs 家族的其他成员 YafB、YghZ 和 YeaE 等可将 GO 转化为乙醇醛，最后生成乙二醇解毒10。有研究表明，YqhE 增加了细菌中其他酶的热稳定性11,12，柠檬欧文氏菌 YqhE 催化的最适温度为32 13，大肠杆菌的 YqhE 在 pH 为 5.08.0 和 35 时活性最强，位于细胞质膜上的 Mg2+和 Ca2+等离子极大地抑制 YqhE 的活性14,15。综上所述，yqhE 在微生物的维生素 C 合成和 MG 解毒中发挥重要作用，但对病原菌致病力的影响还未见报道，同时 yqhE 基因与 MDA（MDA 的分子结构与 MG 和 GO 类似）积累的关系也未见报道。因此本研究以番茄青枯雷尔氏菌 yqhE 基因为研究对象，利用同源重组双交换原理，获得青枯雷尔氏菌 CBM613菌株的 yqhE 基因突变株，通过在 20 和 28 时测定菌株的致病力、维生素 C、MG 和丙二醛（MDA）含量等研究基因功能，为青枯病的防治提供科学依据。1 材料与方法 1.1 材料 野生型番茄青枯雷尔氏菌 CBM613 菌株由西南大学植物保护学院赠送；DH5 大肠杆菌和 TOP10 化学感受态细胞购自美国 Thermo 公司；pMD19-T 载体购自日本 TAKARA 公司；pCVD442、pJQ200SK 和pBBR1MCS2质粒载体本实验室保存；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司、维生素 C 检测分析试剂盒购自武汉艾美捷公司（型号 K661-100）、MG 含量检测试剂盒购自英国ABCAM 公司（型号 ab241006）、MDA 含量检测试剂盒购自北京普利莱公司（型号 E2019）；PrimeSTAR Max Premix（2）购自日本TAKARA公司；Taq DNA polymerase、T4 DNA ligase、Sma I、EcoR V和10Tango buffer 购自立陶宛 MBI 公司；其他试剂皆为国产分析纯。番茄为感病品种中蔬 5 号，光照培养箱（28 30、光周期 16 h、相对湿度 90%），培养，种苗培养至 56 片叶时备用。1.2 突变株及回补菌株的构建 提取青枯雷尔氏菌 CBM613 菌株 DNA 后，利用 yqhE-F/R 引物（表 1）对克隆 yqhE 基因。回收后连接到 T 载体，转化 DH5 大肠杆菌，挑选阳性克隆菌株测序。使用 Expasy 的 ProtParam（https:/web.expasy.org/protparam/）对 CBM613 菌株的 YqhE 蛋白分子量、等电点（PI）等理化性质进行分析；通过TMHMM-2.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）对 YqhE 蛋白进行跨膜结构预测；第 1 期 周大祥等：青枯雷尔氏菌温度相关致病基因 yqhE 功能研究 143 利 用 https:/web.expasy.org/protscale/在 线 分 析 YqhE 的 疏水 性；利 用 SignalP-5.0（https:/services.healt