秦岭特色药用植物桃儿七内生...物的分离鉴定及生物活性研究_李婷.pdf

化学与生物工程 ，基金项目：陕西省教育厅一般专项科研计划项目（），国家自然科学基金青年科学基金项目（），陕西省科技厅青年科技新星项目（），陕西省职业教育教学改革研究课题（）收稿日期：作者简介：李婷（），女，陕西汉中人，硕士，讲师，研究方向：有机化学、天然产物，：；通讯作者：高吉仁（），男，陕西富平人，教授，研究方向：有机化学。：李婷，赵祥，潘会宾，等 秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 化学与生物工程，（）：，（），（）：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究李婷，赵祥，潘会宾，王懿，高吉仁（商洛职业技术学院公共课教学部，陕西 商洛 ）摘要：以秦岭无病害健康桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌为研究对象，采用萃取法从菌丝中分离活性代谢产物，并对其结构进行鉴定，采用（，二甲基噻唑），二苯基四氮唑溴盐（）比色法检测了代谢产物的细胞毒活性，采用 光度法检测了代谢产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，并检测了代谢产物的葡萄糖苷酶抑制活性。结果表明，在桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌代谢产物中分离并鉴定了 个萜类化合物，其中化合物、和为新化合物。化合物、和对 、和 细胞均表现出明显的细胞毒活性；化合物对乙酰胆碱酯酶表现出较强的抑制活性；化合物、和对葡萄糖苷酶均未表现出明显的抑制活性。表明，基于桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌分离出具有抗肿瘤活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性的萜类化合物，为桃儿七内生真菌用于抗肿瘤及治疗阿尔兹海默病新药开发提供了新思路。关键词：桃儿七；内生真菌；烟色拟盘多毛孢菌；萜类化合物；细胞毒活性；乙酰胆碱酯酶抑制活性；抗肿瘤活性中图分类号：，（），（，）：（），（，），（），（），李婷，等：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 年第期 （），（）：（）；桃儿七 （）是小檗科鬼臼亚科桃儿七属植物，主要分布在我国西北和西南地区。作为传统中药材，桃儿七对血病、胎盘滞留及中风等疾病具有显著疗效。研究发现，桃儿七根和茎中糖苷衍生物在睾丸癌、淋巴癌、白血病和小细胞肺癌治疗中发挥着重要作用，且其有效成分鬼臼毒素是合成抗癌药物的前体物质。近年来，随着医学的发展及抗癌药物需求量的增加，桃儿七的需求量也随之增加，但桃儿七已被列入珍稀濒危植物，因此，合理开发其潜在的药用价值具有重要意义。植物内生真菌在植物生长过程中具有促生、抗逆等积极作用，可帮助寄主植物合成次级代谢产物或完成代谢物的生物转化。内生真菌长期与寄主植物共存，可产生与宿主植物相同或相近的具有生物活性的次级代谢产物，这些代谢产物具有抗菌、抗肿瘤及抗氧化等作用，是筛选活性物质的潜在资源。研究者 已从桃儿七根和茎中分离到了可产鬼臼毒素的内生真菌，但真菌代谢产生的生物活性物质不能达到工业生产要求，不利于菌种的扩大筛选。由于桃儿七植物不同产地、不同营养器官中生物活性物质的含量差异较大，作者以秦岭桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌为研究对象，采用萃取法从菌丝中分离活性代谢产物，对其结构进行鉴定，并对其生物活性进行初步分析，为桃儿七内生真菌活性药用成分的开发利用提供理论依据。实验材料、试剂与仪器桃儿七，采自陕西秦岭山，海拔高度 。采样时 挑 选无病害 健康植 株，取 材 部 位 为 植 物 根、茎、叶。马铃薯葡萄糖琼脂（）固体培养基：土豆，葡萄糖，琼脂，水。液体培养基不加琼脂。葡萄糖（分析纯）、冰醋酸（色谱纯）、丙酮（色谱纯）、石油醚（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；琼脂、乙酸乙酯（色谱纯），美国 公司；甲醇（色谱纯），上海科旺化学试剂有限公司；羟丙基葡聚糖凝胶，公司；薄层色谱用硅胶，西安道生化工科技有限公司；目色谱柱硅胶，青岛海洋化工厂；（）（）甲氧基（三氟甲基）苯乙酰氯（），公司。型核磁共振波谱仪，德国 公司；型质谱仪，英国 公司；反相硅胶色谱柱，美国 公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；型垂直流超净工作台，苏州净化设备有限公司；真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；型酶标仪，日本 公司。内生真菌的分离及代谢产物提取对桃儿七根、茎、叶表面消毒后，置于 固体培养基上，以组织块法分离出内生真菌，经纯化后得到烟色拟盘多毛孢菌。将烟色拟盘多毛孢菌活化后接入 液体培养基中，于 振荡培养，抽滤；菌丝用乙酸乙酯甲醇冰醋酸（，体积比）浸提次，合并提取液，经乙酸乙酯萃取后得浸膏。以 反相硅胶色谱柱处理浸膏，采用水及体积分数、丙酮梯度洗脱，采用薄层色谱法（）和反复硅胶柱色谱（洗脱剂为石油醚乙酸乙酯）分离得到 个单体化合物，分别标记为、。化合物的 酯制备及表征分别将化合物、和分为部分，用无水吡啶溶解后加入 的（），于 下搅拌，蒸干有机溶剂，以 凝胶柱纯 化 产 物，通 过 氘 代 甲 醇（）核 磁 共 振（）和异核单量子关系（）确定仲醇羟基的、和位的各个质子的化学位移变化，确定化合物的绝对构型。化合物的细胞毒活性检测以依托泊苷为阳性对照，参照 等 方法，采用（，二甲基噻唑），二苯基四氮唑溴盐（）比色法检测化合物 对人非小细李婷，等：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 年第期 胞肺癌细胞 、人宫颈癌细胞 和人肝癌细胞 的细胞毒活性。将对数生长期的 、和 细胞悬液分别接种于 孔板中，下培养，加入经二甲基亚砜（）稀释的化合物溶液，每个化合物做个复孔，置于培养箱中培养，取出，加入 培养，弃上清，每孔加入 ，测定 处吸光度，按式（）计算细胞抑制率（，）：（）（）式中：为实验组的吸光度；为空白组的吸光度；为对照组的吸光度。乙酰胆碱酯酶抑制活性检测参照 等 方法，采用 光度法检测乙酰胆碱酯酶抑制活性。将 浓度为 的磷酸盐缓冲液（值）加入 孔板中，依次加入 化合物溶液、，二硫代双（硝基苯甲酸）（）、稀释后的乙酰胆碱酯酶溶液（）；以加兰他敏作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液作为阴性对照。混匀后置于 培养箱孵育 ，加入 底物碘化硫代乙酰胆碱（），用酶标仪在 处检测动力学速率，按式（）计算抑制率（，）：（）（）式中：、分别为实验组、阳性对照组、阴性对照组的动力学速率。由于抑制率与浓度之间存在一定的线性关系，通过回归方程计算 值，并依据 值评价乙酰胆碱酯酶的抑制活性。葡萄糖苷酶抑制活性检测参照文献 方法并作适当修改。将 浓度为 的磷酸盐缓冲液（值）加入 孔板中，加入 稀释的不同浓度（、和 ）化合物溶液，然后加入 葡萄糖苷酶（），置于 培养箱孵育 ；取出，加入 底物对硝基苯酚、吡喃葡萄糖苷（）（），置于 培养箱孵育 ；加入 溶液（）终止反应，测定 处吸光度，重复测定次，结果取平均值，并计算半抑制浓度（）。以阿卡波糖作为阳性对照，反应体系总体积为 。数据统计处理采用 软件计算 值，实验数据采用 统计学软件处理，计量资料采用均数标准差（?）表示，两组间计量资料比较采用检验；计数资料以百分率（）表示，采用 检验，表示差异有统计学意义。结果与讨论化合物结构鉴定化合物：浅橙色块状固体；：（，）；（），（），：（），（）；（），：，；，：（，）；核磁共振数据见表。表化合物的 和 数据（）（），（），（，），（），（，），（），（），（），（，），（），化合 物 的 分 子 式 为 （计 算 值 为 ；不饱和度为），综合分析 、和 图谱信息，表明化合物含有个甲基（，），（，），（，），（，）；李婷，等：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 年第期 （，），（，），（，），（，）；个亚甲基（，），（，、，），（，），（，）；（，），（，）；个次甲基（，），（，），（，、，），（，），（，、，）；（，），（，），（，），（，），（，）；个羰基碳 （，）；个脂肪族季碳 （，），（，），（，），（，），（，）。结合 与 的相关关系、及 与 的相关关系，、，、，、，、，、，、，、，、，、，分析化合物与已知化合物 的 数据发现，两个化合物的 数据基本接近。与文献 数据比对发现，化合物与已知化合物 的结构相似，化合物中 （）与化合物 中 （）之间仅相差 ；分析 数据发现，两个化合物的分子离子峰之间仅相差，由此初步确定为失去了一个亚甲基的碎片，再根据化合物的 光谱在 处出现一个宽的吸收谱带，可以确定连接在 的 位上是一个甲氧基，而连接在化合物的位上是一个羟基。通过 数据库搜索，最终确定化合物是一个新的艾里莫芬烷型倍半萜类化合物，命名为 。化合物的相对构型通过 数据推理得到，以圆二色谱（）计算确定其绝对构型（图）。图化合物的关键 、和 ，化合物：淡黄色粉末状固体；：（，）；（），（），：（），（）；（），：，；，：（，）；核磁共振数据见表。表化合物的 和 数据（）化合物（）化合物（），（），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）化合物 的分子式为 （计算值为 ；不饱和度为），综合分析 、和 图谱信息，表明化合物含有个甲基 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；个亚甲基（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，），（，），（，），（，）；个次甲基（，），（，），（，、，），（，），（，李婷，等：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 年第期 ），（，），（，），（，），（，），（，）；（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；个羰基碳 （，），（，），（，）；个脂肪族季碳 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）。结合 与 的相关关系、及 与 的相关关系，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，通过 数据和（）、（）及 之间的长程耦合关系，可以确定化合物中存在一个由 组成的醚键，且化合物是由具有高氧化度的化合物 和化合物之间脱去一分子水成醚缩合而成。通过 数据库搜索和相关文献 调研，确定化合物是一个新的艾里莫芬烷型倍 半 萜 类 化 合 物，命 名 为 ，通 过 数据推理得到其相对构型。对已知化合物 进行单晶培养并结合相关文献调研，利用射线单晶衍射证实了化合物的平面结构并确定其绝对构型（图）。图化合物的关键 、和 ，化合物：淡黄色粉末状固体；：（，）；（），（），：（），（），（），（）；（），：，；，：（，）；核磁共振数据见表。表化合物的 和 数据（）化合物（）化合物（），（），（），（，），（），（），（），（，），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）化合物 的 分 子 式 为 （计 算 值 为 ；不饱和度为），综合分析 、和 图谱信息，表明化合物中含有个甲基 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；个亚甲基（，），（，），（，），（，），（，、，），（，），（，）；（，），（，），（，），（，）；个次甲基（，），（，），（，李婷，等：秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究 年第期 ，），（，），（，），（，），（，、，），（，），（，、，），（，）；（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；个羰基碳 （，），（，），（，）；个脂肪族季碳 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）。结合 与 的相关关系、及 与 的相关关系，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，、，通过 数据和相关数据，可以确定化合物与化合物结构相同，造成 数据不同的原因可能是化合物与的构型不同，因此，化合物命名为 。化合物的相对构型通过 数据推理得到，以 计算确定其绝对构型（图）。图化合物的关键、和 ，化合物：无 色块状晶体；：（，）；（），（），：（），（）；（），：，；，：（，）；核磁共振数据见表。表 化合物的 和 数据（）（），（，），（），（，），（），（，），（），（，），