青岛胶东国际机场通航前捕获蚊蝇的分子鉴定_刘迪.pdf

中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1新发和再发病媒传播疾病（vector-borne dis-eases，VBDs）是全世界的公共卫生问题之一1。病媒生物可在人与人及动物与人之间传播寄生虫、病毒和细菌等病原体，引发疾病，如寨卡病毒病、登革热、黄热病等。全球化、城市化的发展加速了病媒生物随人员、货物或交通工具在地域间的迁移，加大了病媒生物的活动区域和传播疾病的范围。蚊类和蝇类是病媒传播疾病的重要传播媒介，对蚊类和蝇类进Molecular identification of mosquitoes and flies captured atQingdao Jiaodong International Airport before operationLIU Di*，ZHUANG Guodong，XU Li，YU Yingquan，ZHANG Tao，XU Ying，TENG Xindong*Qingdao Customs District，Qingdao，Shandong 266071，ChinaAbstract：ObjectiveTo understand the population of mosquitoes and flies in Qingdao Jiaodong International Airportbefore oporation，and provide data support for the prevention and control of medical vectors and vector-bornediseases.MethodsFrom July to September 2019，four areas including the airport lawn，artificial lake，apron anddormitory area of Jiaodong Airport port were selected.The double-layered net method combined and carbon dioxidemosquito traps were used to capture adult mosquitoes，the fly cages were used to capture flies，and the scoops wereused to capture mosquito larvae and incubate them naturally.The captured mosquitoes and flies were classified andidentified by using morphological identification and molecular identification methods based on mitochondrial COIgene.ResultsFrom July to September 2019，651 mosquitoes（including naturally hatched mosquitoes）and 2 599 flieswere captured，respectively.Combined with morphological identification and molecular identification，it was finallydetermined that there were 6 species of mosquitoes in 4 genera，1 family.The dominant species were Anophelessinensis，Culex pipienspallens and Aedes albopictus，with the constituent rate of 32.26%，27.65%and 25.96%.Therewere 13 species of flies belonging to 12 genera and 4 families，the dominant species were Lucilia sericata，Chrysomyamegacephala and Lucilia cuprina，with the constituent rate of 31.67%，28.51%and 21.51%.After amplifying themitochondrial COI gene of mosquitoes and flies，BLAST showed that the morphological identification were consistentwith molecular identification results.ConclusionWe preliminary understood the mosquito and flies population beforethe operation of Qingdao Jiaodong International Airport，and provide background data for the monitoring of medicalvectors at Jiaodong Airport infuture.Keywords：International airport；Mosquito；Fly；Molecular identification病媒生物控制青岛胶东国际机场通航前捕获蚊蝇的分子鉴定刘迪1，庄国栋2，徐丽3，于滢泉1，张涛1，徐颖1，滕新栋11.青岛海关，山东 青岛266071；2.黄岛海关；3.青岛大港海关摘要：目的了解青岛胶东国际机场转场前蚊类和蝇类的种群，为胶东机场病媒生物及病媒传播疾病的防控提供数据支撑。方法2019年7-9月，在胶东机场口岸的草坪、人工湖、停机坪、宿舍区等4个区域，采用双层叠帐法、二氧化碳诱蚊灯法捕获成蚊，蝇笼法捕获蝇类，勺舀法捕获蚊类幼虫并进行自然孵育。利用形态学鉴定方法和基于线粒体COI基因的分子鉴定方法分类鉴定捕获的蚊类和蝇类。结果2019年7-9月，捕获蚊类（含自然孵育）和蝇类分别为651只和2 599只。结合形态学和分子鉴定，蚊类1科4属6种，优势蚊种为中华按蚊、淡色库蚊和白纹伊蚊，占比分别为32.26%、27.65%和25.96%；蝇类4科12属13种，优势种为丝光绿蝇、大头金蝇和铜绿蝇，占比分别为31.67%、28.51%和21.51%。扩增蚊蝇的COI基因后，BLAST比对显示形态学与分子鉴定结果一致。结论初步了解了青岛胶东国际机场转场前的蚊类和蝇类种群，为胶东机场通航后开展病媒生物监测提供了背景数据。关键词：国际机场；蚊；蝇；分子鉴定中图分类号：R373.3+2文献标识码：ADOI：10.16408/j.1004-9770.2023.01.005基金项目：山东省重点研发计划项目（2021CXGC011306）通信作者：滕新栋，E-mail：20中国国境卫生检疫杂志2023年2月第46卷第1期Chinese Frontier Health Quarantine Feb.2023，Vol 46，No.1行有效监测有重大意义。传统的病媒生物鉴定以形态学鉴定为主，但病媒生物的形态学特征在收集或储存的过程中可能受损，并且不能同时鉴定所有发育阶段，因此只有经验丰富的形态学鉴定专家才能精确鉴定2-3。基于线粒体DNA细胞色素氧化酶I基因（cytochrome oxidase，COI）的DNA条形码技术已经在病媒生物鉴定中得到广泛应用4-5。与形态学鉴定相比，DNA条形码技术更快更准确，可以与传统的形态学鉴定方法共同使用，减少鉴定误差。青岛胶东国际机场位于山东省青岛市胶州市，属于温带季风气候，降水适中，适合病媒生物生存。为了解青岛胶东国际机场通航前蚊蝇的种群情况，利用基于COI基因的DNA条形码技术鉴定捕获的蚊蝇，为胶东机场开航后开展病媒生物监测提供数据。1材料与方法1.1蚊蝇捕获地点2019年7-9月，青岛胶东国际机场的草坪、人工湖、停机坪、施工人员宿舍区等4个区域。1.2蚊蝇捕获方法成蚊采用二氧化碳诱蚊灯法，每个地点放置1个CO2灯，布放时间为日落后，每次布放时长为2 h，每月布放1次6；同时采用双层叠帐法，选择相对避风、朝阴的地方，支起双层叠帐，捕捉人员位于内部封闭蚊帐中暴露两条小腿，其他人员用电动吸蚊器收集停落在蚊帐上的蚊类，持续2 h。蚊幼虫采用勺舀法，用500ml标准水勺在人工湖水面蚊幼虫活动处迅速采集水样，将幼虫带回实验室孵育。蝇类采用蝇笼法。用标准规格的诱蝇笼，用臭海鱼作诱饵，每个地点放置1个捕蝇笼，晨放晚收。1.3形态学鉴定根据口岸实用医学媒介生物彩色鉴定图谱和中国国境口岸医学媒介生物鉴定图谱对捕获的蚊蝇进行形态学鉴定7。1.4DNA 条形码技术鉴定1.4.1引物线粒体COI通用引物8-9LCO1490：5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3和HCO2198：5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.4.2核 酸 提 取 及COI基 因 扩 增使 用Tissuelyser-24多样品组织研磨机研磨单只蚊或蝇的后足，用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0提取DNA。PCR反应扩增体系7：10TaqDNA聚合酶缓冲液3 l，TaqDNA聚合酶0.5 l，dNTPs 2 l，上、下游引物各1 l，模板DNA 1 l，无菌双蒸水21.5 l。PCR反应条件为：94 3min，94 1min，50 1min，72 2 min，共35个循环；延伸72 7 min。阳性PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。1.4.3序列分析测序结果利用NCBI的BLAST功能进行比对，根据比对结果确定蚊类和蝇类的种类，并将形态学鉴定结果与分子鉴定结果进行对比。2结果2.1蚊蝇捕获情况2019年7-9月，在青岛胶东国际机场的草坪、人工湖、停机坪、施工人员宿舍区等4个区域，共使用12个诱蚊灯和2顶双层叠帐用于捕获成蚊，12个诱蝇笼用于捕获蝇类，50勺蚊蚴用于自然孵育。捕获蚊幼虫350只，成功孵育185只，其中雄性102只、雌性83只。经形态学鉴定，包括中华按蚊110只、淡色库蚊75只（表1）。诱蚊灯、双层叠帐、勺舀法共捕获蚊类651只（含自然孵育185只），除自然孵育有雄蚊外，其他均为雌蚊。经形态学鉴定，隶属于1科4属6种，分别为中华按蚊210只、淡色库蚊180只、白纹伊蚊169只、刺扰伊蚊50只、凶小库蚊20只和常型曼蚊22只。优势种为中华按蚊（32.26%）、淡色库蚊（27.65%）和白纹伊蚊（25.96%）。见表2。蚊类名录：按蚊属Anopheles Meigen，1818中华按蚊Anopheles sinensisWiedemann，1828伊蚊属Aedes Meigen，1818白纹伊蚊Aedes albopictus Skuse，1895刺扰伊蚊日本亚种Aedes vexansnipponiiTheobald，1907库蚊属Culex Linnaeus，1758凶小库蚊Culex modestus Ficalbi，1889淡色库蚊Culex pipienspallens Caquillett，1898曼蚊属Mansonia Blanchard，1901常型曼蚊Mansonia uniformis Theobald，1901表1自然孵育蚊类（只）Tab.1Naturally incubate mosquitoes（n）蚊类种类Mosquito s