耐索拉非尼肝癌细胞株的构建及耐药机制研究_曾琼戎.pdf

论著耐索拉非尼肝癌细胞株的构建及耐药机制研究曾琼戎，刘泽峰，王文娟，黄雪莲，黎凤炎，夏雨艳，张国基金项目:国家自然科学基金项目(编号:81860654)作者单位:533000百色，右江民族医学院研究生院(曾琼戎，黄雪莲，黎凤炎);530021南宁，广西壮族自治区人民医院(广西医学科学院)消化内科(曾琼戎，刘泽峰，王文娟，黄雪莲，夏雨艳，张国)作者简介:曾琼戎，在读硕士研究生，研究方向:肝癌等肝脏疾病的分子发病机制及现代化治疗研究。E-mail:690947124 qq com通信作者:张国，医学博士，主任医师，博士研究生导师，二级教授，研究方向:肝癌等肝脏疾病的分子发病机制及其现代化治疗研究。E-mail:zhangguogx hotmail com 摘要 目的构建耐索拉非尼肝癌细胞株并探讨其耐药机制。方法应用 HepG2、Huh7 细胞通过浓度递增法建立耐索拉非尼细胞模型。通过 CCK8 法检测细胞对不同浓度索拉非尼的敏感性。通过划痕实验检测细胞的迁移能力。通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。通过荧光实时定量 T-PC 和 Western blot 实验检测凋亡相关因子 caspase-3 和自噬标志因子 P62、LC3 的表达水平。结果获得耐索拉非尼肝癌细胞株 HepG2-S、Huh7-S。随着索拉非尼药物干预浓度的升高，耐药细胞株及野生型细胞株的存活率均逐渐降低。HepG2-S细胞的半数抑制浓度(IC50)显著高于 HepG2 细胞(15.74 0.38)M vs(7.27 0.44)M;t=5.450，P 0.001;Huh7-S 细胞的 IC50显著高于 Huh7 细胞(11.73 0.27)M vs(4.92 0.31)M;t=4.807，P 0.001。相较于野生型细胞株，耐药细胞株具有更高的抗凋亡和迁徙能力。耐药细胞株的 caspase-3、P62 表达水平显著低于野生型细胞株(P 0.05)，而 LC3 表达水平显著高于野生型细胞株(P 0.05)。结论耐索拉非尼肝癌细胞株 HepG2-S、Huh7-S 具有更强的抗凋亡、抗生殖抑制和迁移能力，且自噬水平更高，为研究肝细胞癌对索拉非尼的耐药机制提供了基础。关键词 索拉非尼;耐药性;肝细胞癌;自噬 中图分类号 735.7 文献标识码 A 文章编号 1674 3806(2023)02 0135 06doi:10 3969/j issn 1674 3806 2023 02 07Construction of sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell line and study on its drug-resistant mechanismZENG Qiong-rong，LIU Ze-feng，WANG Wen-juan，et al Graduate School，Youjiang Medical University for National-ities，Baise 533000，China Abstract ObjectiveTo construct sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell line and to explore its drug-resistant mechanism MethodsHepG2 and Huh7 cells were used to establish sorafenib-resistant cell models by step-wise increase in drug concentrations method The sensitivity of cells to sorafenib at different concentrations was detectedby CCK8 assay The migration ability of cells was detected by wound healing assay The apoptosis of cells was analyzedby flow cytometry The expression levels of apoptosis-related factor caspase-3 and autophagy marker factors P62 and LC3were detected by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(T-PC)and Western blotesultsSorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell lines HepG2-S and Huh7-S were obtained With the increaseof sorafenib intervention concentration，the survival rates of drug-resistant cell lines and wild-type cell lines decreasedgradually The half inhibitory concentration(IC50)of HepG2-S cells was significantly higher than that of HepG2 cells(15.74 0.38)M vs(7.27 0.44)M;t=5.450，P 0.001 The IC50of Huh7-S cells was significantlyhigher than that of Huh7 cells(11.73 0.27)M vs(4.92 0.31)M;t=4.807，P 0.001 Compared withthe wild-type cell lines，the drug-resistant cell lines showed higher anti-apoptosis and migration ability The expres-sion levels of caspase-3 and P62 in the drug-resistant cell lines were significantly lower than those in the wild-type celllines(P 0.05)，while the expression level of LC3 in the drug-resistant cell lines was significantly higher than that inthe wild-type cell lines(P 0.05)ConclusionSorafenib-resistant hepatocellular carcinoma cell lines HepG2-S andHuh7-S have stronger anti-apoptosis，anti-reproductive inhibition and migration ability，and higher autophagy level，which provides a basis for studying the mechanism of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma Key words Sorafenib;Drug resistance;Hepatocellular carcinoma;Autophagy531中国临床新医学2023 年2 月第 16 卷第 2 期肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率和病死率在国内外均呈上升趋势1-2，其中超过半数的病例发生在我国。HCC 的治疗受到较多局限性，除了患者确诊较晚外，还与 HCC 的异质性、化疗耐受等特点相关。索拉非尼(sorafenib)作为一种酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)，长期以来一直是唯一被批准用于晚期 HCC 治疗的药物，但大多数患者显示出原发性或获得性耐药，使其疗效受限3。近年，也有其他多激酶抑制剂(乐伐替尼、卡博替尼、瑞戈非尼)、人单克隆抗体(雷莫芦单抗)和免疫检查点抑制剂(纳武单抗、派姆单抗)被批准用于全身治疗 4-6。但尽管如此，患者的中位生存期并未显著增加 7。因此，迫切需要了解 HCC 索拉非尼耐药性的分子机制，以提高当前药物的疗效，并开发更有效的药物。为此，本课题组在体外成功构建了两种耐索拉非尼肝癌细胞株，并对索拉非尼的耐药机制进行了探索，为 HCC 治疗提供理论模型和基础。1材料与方法1.1主要实验试剂索拉非尼(MCE，HY-10201)，高糖 DMEM 培养基(Gibco，C11995500BT)，澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco，10099-141)，青链霉素(penicillin-streptomycin，PS;索莱宝，PI400-100)，CCK8 试剂盒(MCE，HY-K0301)，Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒(赛默飞，88-8005-72)，TIzol(赛默飞，15596-026)，逆转录试剂盒(莫纳，M05101)，SYBGreen qPCMix(莫纳，MQ10301S)。兔单克隆一抗:caspase-3、自噬受体蛋白 P62、LC3、-actin(Abcam 公司)。山羊抗兔二抗(Affinity 公司)。PC 所用引物均由上海生工设计。1.2野生型 HCC 细胞株 HepG2、Huh7 的培养野生型人肝癌细胞株 HepG2、Huh7，购自中国科学院上海细胞所，以含10%FBS+1%PS 的 DMEM 培养基进行细胞培养，培养箱条件设置为 37、5%CO2。1.3耐索拉非尼人肝癌细胞株的建立采用浓度递增法构建耐药株，具体流程如下:稳定培养野生型人肝癌细胞株 HepG2、Huh7 至 P3 代，密度达 30%时进行传代，贴壁后加入含 3 M 索拉非尼的完全培养基(含15%FBS)。培养 3 d 后更换为不含索拉非尼的完全培养基，待细胞长满后，再次以30%进行传代。细胞贴壁后加入 4 M 索拉非尼，培养 3 d 后更换成不含索拉非尼的完全培养基，待细胞长满再次以 30%进行传代。细胞贴壁后加入5 M 索拉非尼，培养3 d后更换成不含索拉非尼的完全培养基。待细胞长满后再以30%进行传代。以此类推，直至加入含10 M 索拉非尼的完全培养基经3 d 培养细胞可长满。之后以含5 M 的索拉非尼的完全培养基维持培养1 个月以上，所得细胞株即耐索拉非尼人肝癌细胞株(HepG2-S和 Huh7-S)，以含15%FBS+1%PS 的 DMEM 培养基进行培养，并用于后续实验。1.4CCK8 实验方法取对数生长期细胞株HepG2、Huh7、HepG2-S 和 Huh7-S，以 5 000 cells/孔接种至96 孔板，培养过夜，更换含梯度浓度索拉非尼(2.5、5.0、10.0、20.0 M)的完全培养基，另设等体积不加药物处理的阴性对照组和空白对照组，每组 3 个复孔。培养24 h 后，小心吸弃旧培养基，然后向每个孔加入90 l 的10%FBS DMEM 和 10 l 的 CCK8 试剂，37 培养箱继续孵育3 h。应用酶标仪检测每个孔 450 nm 处的吸光度值(OD 值)。细胞存活率=(实验组OD 值 空白组OD 值)/(对照组OD 值 空白组 OD 值)100%。1.5细胞形态学观察将细胞接种于 6 cm 培养皿中，密度为2 105cells/孔，在附有电荷耦合原件图像传感器的显微镜下观察细胞轮廓和形态，并拍照记录。1.6流式细胞术检测细胞凋亡按照