颞下颌关节紊乱病动物模型构建进展_周文成.pdf

海南医学2023年2月第34卷第4期Hainan Med J,Feb.2023.Vol.34,No.4颞下颌关节紊乱病动物模型构建进展周文成 综述沈山 审校暨南大学口腔医学院，广东广州510635【摘要】颞下颌关节紊乱病(temporomandibular joint disorders，TMD)在人群中发病率一直居高不下，严重影响了人们的生活质量。由于其发病机制复杂、具体病因不明，加之颞下颌关节解剖结构复杂，且不易获取活体标本，给TMD相关科学研究造成了极大困难。因此颞下颌关节紊乱病动物模型研究符合时代热点。目前常用于颞下颌关节紊乱病动物造模的方法有化学注射法、机械刺激法、手术诱导法、基因工程修饰。本文就颞下颌关节紊乱病实验动物模型的建立方法及其在实验动物的组织学表现、细胞水平表现、分子学水平表现等各个方面的研究进展作一综述。【关键词】颞下颌关节紊乱病；动物模型；发病机制；实验动物【中图分类号】R-332【文献标识码】A【文章编号】10036350（2023）04059613Research progress of animal model of temporomandibular joint disorders.ZHOU Wen-cheng,SHEN Shan.School ofStomatology,Jinan University,Guangzhou 510635,Guangdong,CHINA【Abstract】The incidence of temporomandibular joint disorders has always been high in the crowd,which hascaused many troubles to peoples lives.Due to the complexity of its pathogenesis and unknown cause,coupled with thecomplicated anatomy of the temporomandibular joints,and that it is not easy to obtain living specimens,it has causedgreat difficulty to TMD-related scientific research.So the animal model research about temporomandibular joint disor-ders is in line with the hot spots of the times.At present,the method of making animals in temporomandibular joint disor-ders contains chemical injection,mechanical stimulus,surgical induction method,and genetic engineering modification.This article refers to research progress in various aspects such as the method of establishing animal models of temporalmandibular joint disorders and their historical performance,cell level performance,and molecular science performancein experimental animals.【Key words】Temporomandibular joint disorders;Animal model;Pathogenesis;Experiment animal 综述 doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2023.04.030第一作者：周文成(1995)，男，硕士，住院医师，主要研究方向为颌面外科。通讯作者：沈山(1972)，男，博士，副主任医师，主要研究方向为颌面外科，E-mail：。动物模型与人类生理特点相似、疾病表征相近、解剖结构相符合的动物，通过实验方法人为地改造或者利用某些动物的天然属性，从而得到能够外推到人类目标群体的真理。它是进入临床实验前不可或缺的的一部分，是基础实验步入临床研究的关键步骤。实验动物可以模拟人类疾病的发病过程、病理改变、临床表现，从而成为目前究疾病病因、发病机制、治疗方法的重要途径。近年来，有关颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorders，TMD)研究的动物模型层出不穷。根据不同的病因和症状，可以采用不同的方式来诱导，主要分为以下四种方式：化学注射法、机械刺激法、手术诱导法、基因工程修饰法。根据TMD的不同病因，采取各种检索方式和选择标准，使用各种搜索词的组合，如颞下颌关节紊乱病、动物模型、实验动物、发病机制。对相关文献、综述、会议文章进行检索、纳入和综述，以寻找TMD的动物模型建立方法。1 不同化学诱导剂作用机理及评价1.1完全弗氏佐剂诱导完全弗氏佐剂(com-plete freunds adjuvant，CFA)是一种油盐乳液，热灭活的结核分支杆菌悬浮其中，能够有效地诱导抗体生成。CFA活性来自于油滴中免疫抗原的持续释放，并刺激局部免疫反应。Wang等1以7周龄雌性SD大鼠为实验对象，在大鼠适应环境后的第1天和第14天分别向 大鼠 的颞 下 颌关 节(temporomandibular joint，TMJ)上腔注射CFA。在首次注射后的第1天，实验组相对于对照组，头围平均增加了5 mm，提示关节发生严重肿胀，且头部抽离阈值(head withdraw threshold)明显低于对照组，表明实验组大鼠产生剧烈疼痛；实验组大鼠HE染色结果显示大鼠表现出慢性滑膜炎的特征：滑膜衬里细胞增生，伴有大量单核细胞浸润，且关节盘出现增厚和变形；实时荧光定量qPCR(RT-qP-CR)结果显示iNOS(诱导型一氧化氮合成酶)、IL-1(白介素-1)表达量明显高于对照组，这导致关节盘炎性增厚，湿重和净重增加，胶原蛋白和蛋白聚集多糖含量升高。这些结果验证了Wang等1的假设：持续炎症是颞下颌关节退行性变的诱发因素。然而，值得注意的是关节炎大鼠的关节盘前带和中间带的单核细胞总数显著高于对照组，但后带的单核细胞总数在对596Hainan Med J,Feb.2023.Vol.34,No.4海南医学2023年2月第34卷第4期照组和实验组之间无统计学意义。Barbin等2将CFA与牛二型胶原蛋白(type bovine collagen，C)混悬液注射入大鼠尾部，5 d后在同一部位进行二次注射。实验组的IL-1、TNF-分泌水平明显高于对照组，表明组织处于急性炎症期。而IL-10的表达量却低于对照组。同时组织学分析发现CFA组 TMJ髁突顶端区域纤维层、增生层厚度明显低于对照组，同时实验组所有动物均表现出髁突软骨和软骨下骨胶原纤维退化，胶原纤维数量减少。McIlwrath等3通过将CFA注射入TNF-缺失小鼠颞下颌关节内并联合结肠刺激构建了“双重打击”TMD炎症模型。具体的构建过程如下：TNF-受体缺失小鼠麻醉后于TMJ关节腔内注射CFA，称为一次打击。三周之后麻醉小鼠，将聚乙烯管插入结肠内，再通过注射器注入芥子油，称为二次打击。行为学反应测定结果表明CFA诱导的实验动物单侧头部抽离阈值显著降低，在注射后第一天降低幅度达到最大，提示动物可能对机械刺激更加敏感，在第五天恢复至基线水平。而热平板实验结果在野生型和突变型小鼠之间没有差异。细胞因子检测结果显示促炎因子在CFA刺激后明显增加，尤其是在诱导后的第14天，例如TNF-、CCL5、CXCL9、CCL2、CXCL10等，提示组织可能处于急性炎症期。CFA诱导的小鼠对福尔马林注射入唇引起的急性炎症反应程度更加剧烈，表明二者可能存在协同作用。笔者认为CFA是目前动物实验常用的免疫诱导制剂，可以使抗原持续释放，同时又能非特异性地诱导机体的免疫性应答，一般多用于诱导实验动物的初次免疫。但注射CFA而导致的局部组织炎症、肉芽肿性改变，是否会对实验产生不良影响，目前仍需要验证。且CFA诱导制剂起效快，失效也快，不适合进行短期暴露。同时利用CFA的大多数动物模型都集中在小型啮齿动物上，因此在大型动物模型中将需要更多的研究，以确保结果的普适性。1.2卵蛋白诱导类风湿性关节炎(rheumatoidarthriti，RA)是一种自身免疫性疾病，可累及手足小关节和颞下颌关节，同时伴有全身的其他表现。血管生成是其发病机制的重要组成部分，血管生成可以促进局部炎症细胞迁移和疼痛受体的增加。因此检测血管翳生成情况是评估RA活动性及不同疗法效果的重要内容。Liu等4创建了卵蛋白诱导兔关节炎模型(ov-albumin induced arthritis，OIA)，使用纵向能量多普勒血流显权像(power doppler imaging，PDI)和对比增强超声(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)测量来评估疾病不同阶段的血管生成情况，并分析测量值与血管生成的不同病理指标之间的相关性。具体模型建立方法如下：雄性新西兰大白兔作为实验组注射鸡蛋清的白蛋白和CFA的混合液，对照组接受等量生理盐水注射。16周后，使用超声(ultrasoun，US)作为常规评估手段，超声引导下对OIA兔膝关节滑膜进行活检，免疫组化检测CD31和血管内皮生长因子(vascular endo-thelial growth factor，VEGF)的表达。结果显示：第612周，OIA 兔的滑膜中CD31 和 VEGF 表达增加，同时其表达量与能量多普勒图像分级、CEUS 分级和峰值强度呈显著正相关。将功率多普勒图像等级、CEUS等级和峰值强度，尤其是CD31表达量结合时，准确地表明了RA兔模型中滑膜血管化的程度。笔者认为新西兰大白兔体型较大、体质结实、成熟早、生长快，由于其耳大、皮肤白色和血管清晰等特点，是一种用于研究RA疾病的理想动物。同时该动物模型成功模拟了人类RA的疾病进程，实验兔在第 68 周出现早期疾病表现(炎症)，在第 812 周出现中期疾病表现(血管翳形成)，在第 1216 周出现晚期疾病表现(纤维化)，为学者了解RA的发病机制打下了深厚的实验基础，同时有利于学者更好地对RA病情进行评估。但目前由种属差异、饲养环境不同带来的实验结果的差异仍然是一个急需解决的问题。1.3 胶原酶、胶原抗体诱导骨关节炎(osteoar-thritis，OA)的治疗药物选择十分有限，需要替代治疗。大量临床数据表明，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)可能是人类OA的治疗靶点。Lee等5通过构建胶原酶诱导性骨关节炎模型(collagenase inducedarthritis model，CIOA)，在大鼠关节腔内注射型胶原酶对照组注射生理盐水，在CIOA诱导成功后，腹腔注射GM-CSF单克隆抗体，第23天出现了持续性疼痛，组织学检测证明该组出现了明显的软骨损伤。半月板损伤是膝关节骨性关节炎发生和发展的危险因素之一，但聚焦在半月板损伤上的动物模型却鲜有报道，在CIOA模型中，还没有关于半月板退行性变的研究。在这种模型中，高纯度的胶原酶被注入关节内，损伤了关节韧带，导致关节不稳定。Utomo 等6构建了这种CIOA模型，C57BL/6小鼠关节内注射胶原酶诱导膝关节骨关节炎。分别于1 d、3 d、7 d、14 d、28 d、56 d处死小鼠，取膝关节进行组织学分析。取16周龄未诱发骨性关节炎的小鼠膝关节作为对照。经硫胺染色切片评估半月板损伤、半月板脱出和关节软骨损伤。结果表明半