扑草净胁迫对四角蛤蜊解毒相关基因表达的影响_刘丽娟.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 17 卷 第 6 期 2022 年 12 月Vol.17,No.6 Dec.2022 基金项目:山东省重点研发计划项目(2018GHY115041);山东省现代农业产业技术体系贝类产业创新团队(SDAIT-14-08)第一作者:刘丽娟(1977),女,学士,研究方向为海洋生物生态学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20210723001刘丽娟,姜向阳,刘慧慧,等.扑草净胁迫对四角蛤蜊解毒相关基因表达的影响J.生态毒理学报,2022,17(6):333-344Liu L J,Jiang X Y,Liu H H,et al.Prometryn stress in expression of detoxification-related genes inMactra veneriformisJ.Asian Journal of Ecotoxicol-ogy,2022,17(6):333-344(in Chinese)扑草净胁迫对四角蛤蜊解毒相关基因表达的影响刘丽娟,姜向阳,刘慧慧,黄会,宫向红,何金霞,刘小静,王玮云,张秀珍*山东省海洋资源与环境研究院,山东省海洋生态修复重点实验室,烟台 264006收稿日期:2021-07-23 录用日期:2021-11-01摘要:扑草净是我国常用除草剂的主要成分,其药物残留在近岸海域广泛分布。在水温(151)条件下,采用半静态水质接触染毒法开展胁迫实验。以-肌动蛋白(-Actin)基因为参比,分别研究了不同浓度扑草净胁迫对四角蛤蜊消化腺和鳃组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、细胞色素 P450 第四亚族(cytochrome P450,CYP4)和金属硫蛋白(metallothio-nein,MT)6 种解毒相关基因表达的影响规律。结果显示,6 种基因表达调控对扑草净胁迫反应灵敏,在扑草净质量浓度分别为0.2、1.0 和 10 g L-1的养殖海水中,随着胁迫时间延长,四角蛤蜊消化腺呈现SOD、CAT、GSH-Px、GST和MT等5 种基因表达均先上调、CYP4基因表达先下调,而后反复波动变化的趋势;鳃呈现SOD、GSH-Px和GST等 3 种基因表达均先上调,CYP4基因表达先下调,1.0 g L-1组的CAT基因表达先下调其他组先上调、MT基因表达先上调其他组先下调,而后反复波动变化的趋势。GST可作为扑草净对四角蛤蜊污染潜在的生物标志物。该结果为评价扑草净残留对海洋生态环境安全风险提供了参考依据。关键词:扑草净;四角蛤蜊;基因表达;解毒文章编号:1673-5897(2022)6-333-12 中图分类号:X171.5 文献标识码:APrometryn Stress in Expression of Detoxification-related Genes in MactraveneriformisLiu Lijuan,Jiang Xiangyang,Liu Huihui,Huang Hui,Gong Xianghong,He Jinxia,Liu Xiaojing,Wang Weiyun,Zhang Xiuzhen*Shandong Marine Resource and Environment Research Institute,Shandong Key Laboratory of Restoration Marine Ecology,Yantai264006,ChinaReceived 23 July 2021 accepted 1 November 2021Abstract:Prometryn is a herbicide that is widely used in China and frequently detected in coastal environment.Inthis study,Mactra veneriformiswere exposed to seawaters with prometryn at 0,0.2,1.0 g L-1,and up to 10.0 g L-1by the semi-static method at(151).Digestive glands and gills in each group ofMactra veneriformiswerecollected at exposure time 6,24,48,96,144,240,360 and 504 h respectively.The expression of detoxification-re-lated genes,superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT),glutathione peroxidase(GSH-Px),glutathione S-transfer-334 生态毒理学报第 17 卷ase(GST),cytochrome P450(CYP4)and metallothionein(MT),were analyzed in relative quantification by reversetranscription,quantitative real-time polymerase chain reaction(qPCR)technology and 2-ctmethod with-Actingene as the reference gene.The results showed that the regulation of expression of these genes was sensitive to theprometryn and fluctuated over time.The expression ofSOD,CAT,GSH-Px,GST,MTmRNA was increased andCYP4mRNA decreased in the digestive glands ofMactra veneriformisat exposure time 6 h.Subsequently,the ex-pression of these genes was fluctuated in the digestive glands ofMactra veneriformisin all 3 treatment groups.Inthe gill ofMactra veneriformis,the expression levels ofSOD,GSH-Px,GSTmRNA increased andCYP4mRNAdecreased in all 3 treated groups at 6 h,when the expression levels ofCATmRNA decreased in the 1.0 g L-1ex-posure group and increased in other groups.Meanwhile,the expression levels ofMTmRNA was increased in the1.0 g L-1exposure group and decreased in other groups at 6 h,and then fluctuated.GSTcan be used as a poten-tial mRNA biomarker for the impact of prometryn onMactra veneriformis.The results provide a promising way forthe evaluation of the risk of prometryn residue on marine ecological environment safety.Keywords:prometryn;Mactra veneriformis;gene expression;detoxification 扑草净(prometryn)化学名称为 4,6-双异丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪,分子式为 C10H19N5S,是一种高效低毒的内吸型除草剂,在农业生产中主要用于防除一年生禾本科及阔叶草1。美国、巴西和加拿大等分别将扑草净作为除草剂或杀虫剂用于农业生产;不过为避免扑草净对环境、人类和动物造成潜在的健康风险,欧盟自 2004 年起禁止其作为农药销售和使用2;在我国,扑草净不仅在农业中广泛应用于防除杂草,还在水产养殖中用于清除大型藻类3,但由于其在鱼体内代谢情况不明,无法对食品安全性进行评价,2010 年水产用扑草净粉被列入中华人民共和国农业部兽药试行标准废止目录(公告第1435 号)4。扑草净在 20 水中溶解度为 33 mg L-1,属于低水溶性,不易渗入土层下面,并且其化学性质稳定,半衰期长,难降解,容易随着降水、淋溶和径流的作用由土壤迁移入水体5,扑草净残留在国内外海洋环境中常有检出6-10。2012 年以来,日本在从中国进口的海水贝类中多次检出扑草净残留超过基准值(0.01 mgkg-1)11-12。我国 7 个省份多种养殖水产品中检出扑草净13,水环境中扑草净残留对水生生物的影响受到广泛关注。谢剑等14和王田田等15先后研究了扑草净对不同海洋生物的急性毒性;田秀慧等16、刘丽娟等17和张望等18研究发现,刺参、菲律宾蛤仔和文蛤均对养殖海水中的扑草净有一定富集效应;Star 等19-20和黄会等21研究发现,水体中的扑草净对鲤鱼、克氏原螯虾和四角蛤蜊抗氧化酶活性产生影响。但在 mRNA 水平上的研究不足,迄今为止尚未见扑草净对水生生物的基因表达影响研究。本文以我国沿海重要海水滩涂养殖贝类四角蛤蜊(Mactra veneriformis)为实验对象,根据项目组2018 年对黄河口海域除草剂污染调查结果,海水中扑草净平均检出浓度为 0.24 g L-1,最高检出浓度1.09 g L-1,设计 3 个实验浓度 0.2、1.0 和 10.0 g L-1并开展胁迫试验,经筛选以肌动蛋白-Actin基因作为参比基因22-23,研究了不同浓度扑草净胁迫下,四角蛤蜊 6 个解毒相关基因:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transfer-ase,GST)、细胞色素 P450 第四亚族(cytochromeP450,CYP4)和金属硫蛋白(metallothionein,MT)基因表达随时间变化的规律,首次从 mRNA 水平揭示了扑草净对水生生物的生理影响,探讨了其致毒机理,以期为海洋生态环境保护提供依据。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 材料与试剂四角蛤蜊取自东营市黄河口滩涂贝类养殖区,体质量(8.380.51)g,壳长(4.100.38)cm。小新月菱形藻藻种来自山东省海洋资源与环境研究院藻种室。养殖用海水取自烟台近海,盐度 301,pH 7.98.1,经砂滤后使用。扑草净标准品(纯度98.0%),德国 Dr.Ehren-storfer 公 司;M-MLV Reverse Transcriptase(Pro-mega);SYBRPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(