农药对海洋微藻中肋骨条藻的毒性效应及其生物降解_张子莲.pdf

农药对海洋微藻中肋骨条藻的毒性效应及其生物降解张子莲1,3*,陈秋兰5,陈博2,4,董陶杰2,陈猛1,21.近海海洋环境科学国家重点实验室厦(厦门大学),厦门 361102;2.滨海湿地生态系统教育部重点实验室,厦门大学环境与生态学院,厦门 361102;3.福建省海洋碳汇重点实验室,厦门大学海洋与地球学院,厦门 361102;4.河北大学生命科学学院,保定 071000;5.福建省泉州环境监测中心站,泉州 362000*通讯作者,E-mail: 通讯作者,E-mail:收稿日期:2022-07-26;收修改稿日期:2022-12-27;接受日期:2023-01-09;网络版发表日期:2023-02-22国家重点研发计划项目(编号:2016YFA0601400)和国家自然科学基金项目(批准号:42188102、42141003、41861144018)资助摘要农药危害人畜健康并对环境造成污染,因此被认为是毒性污染物.毒死蜱、乙草胺和三氯杀螨醇作为有机磷、酰胺和有机氯类农药的代表在农业中被广泛应用,并在水生环境中被普遍检出.然而,农药对海洋微生物的毒性尚不明确.本研究分析了农药对典型海洋微藻中肋骨条藻的毒性效应.用三种农药单独或联合处理中肋骨条藻,通过分析处理过程中藻细胞密度和叶绿素a含量,研究了农药对中肋骨条藻的毒性效应.同时,对培养基中氮/磷比的变化和农药的降解也进行了分析.单一农药的急性毒性分析表明,乙草胺对中肋骨条藻的生长具有最显著的抑制作用,其次是三氯杀螨醇和毒死蜱.乙草胺破坏了中肋骨条藻的细胞膜.不同农药组合的联合毒性分析表明,乙草胺加剧了三氯杀螨醇和毒死蜱的毒性.相反,三氯杀螨醇的存在降低了乙草胺和毒死蜱的毒性.在中肋骨条藻生长后期,培养基中氮/磷比明显升高,但毒死蜱处理组培养基中氮/磷比值显著低于乙草胺和三氯杀螨醇处理组.研究发现中肋骨条藻促进了农药的降解,说明微藻可能有助于海洋环境中这些农药的去除.然而,农药对海洋微藻的毒性机制和农药在海洋中的最终去向仍需更深入的研究.关键词微藻,农药,毒性,降解,中肋骨条藻1引言农药是现代农业系统中必不可少的化学物质,其通过控制杂草、昆虫和植物病害来显著提高作物和粮食产量(Bondareva 和Fedorova,2021).全球每年农药使用量约为1.01062.5106吨(Jiao等,2019).中国是农业大国,平均每公顷农药使用量约为全球平均水平的1.54倍(Zhang等,2015;Lai,2017).农药一般针对目标生物而选用,但是只有不到1%的农药能到达目标生物,而大部分进入大气、土壤和水体中,最终汇入海洋中文引用格式:张子莲,陈秋兰,陈博,董陶杰,陈猛.2023.农药对海洋微藻中肋骨条藻的毒性效应及其生物降解.中国科学:地球科学,53(3):644655,doi:10.1360/N072022-0213英文引用格式:Zhang Z,Chen Q,Chen B,Dong T,Chen M.2023.Toxic effects of pesticides on the marine microalga Skeletonema costatum and their biologicaldegradation.Science China Earth Sciences,66(3):663674,https:/doi.org/10.1007/s11430-022-1064-7 2023 中国科学杂志社中国科学:地球科学2023 年第 53 卷第 3 期:644 655SCIENTIA SINICA T论 文(Vymazal和Bezinov,2015;Tsaboula等,2019).因此,农药残留已成为水污染的主要原因之一(Sun等,2019).疏水性农药毒死蜱、乙草胺和三氯杀螨醇分别属于有机磷、氯乙酰胺和有机氯类农药,因其生物活性高及成本低的特点被广泛用于农业生产(Hu等,2020),并且也广泛分布于水体环境(Xiao等,2017;Lei等,2018;Hu等,2020;Li等,2021).在中国大连饮用水源碧流河水库的地表水中可检测到乙草胺,最高浓度达到61.9ng L1(Dong等,2019).而对中国七个典型流域的农药分布开展的调查发现,在80%以上的取样点中检测到包括乙草胺在内的五种农药,平均浓度为5.62225.93ng L1(Xu等,2019).在中国福建省第二大河流九龙江的水体和沉积物中普遍检测到三氯杀螨醇(Zheng等,2016).毒死蜱和三氯杀螨醇不仅分布于沿海表层海水中(Liu等,2018;Ivorra等,2019),也在西太平洋的沉积物中被检测到(Ge等,2021).这些结果表明,农药是环境中持久且难以降解的污染物.虽然在环境中检测到的农药含量可能较低,但是通过生物富集和生物放大作用,其浓度可达到初始浓度的7万倍(Kim等,2016),并且施用后95%以上的农药可能会影响到水生无脊椎动物、两栖动物、鸟类、有益昆虫和宠物等非目标生物(Affum等,2018).例如,毒死蜱可以改变鱼类和水生无脊椎动物群落,从而影响生物的多样性(Affum等,2018).研究者以斑马鱼为模式生物研究了手性乙草胺的神经毒性,结果表明,乙草胺可以影响斑马鱼幼体的运动行为,并在斑马鱼的早期发育过程中诱发神经毒素(Sarangi等,2019).总体而言,有关农药毒性的研究主要集中于高等生物.硅藻是能进行光合作用的单细胞原生生物,也是分布最广的微藻,对海洋和淡水环境中的全球初级生产力和生物地球化学循环具有重要作用(Falciatore等,2020).然而,有关农药对微藻毒性的研究较少.微藻中肋骨条藻Skeletonema costatum(S.costatum)是一种浮游硅藻,广泛分布于沿海水域.中肋骨条藻已被用作模式微藻物种来分析聚苯乙烯颗粒及重金属汞等有机或无机污染物的毒性效应(Yi等,2019;Zhang等,2019;Ding等,2019;Zhu等,2020).本研究利用三种具有代表性的农药(包括毒死蜱、三氯杀螨醇和乙草胺)来单独或联合处理中肋骨条藻,分析了处理过程中微藻的细胞密度和叶绿素a含量,以揭示农药对海洋微藻的毒性效应.并分析了微藻对这三种农药的降解,以阐释农药在海洋环境中的去向.本研究系统分析了多种农药的毒性效应,有助于更精准地评估农药的风险.2材料和方法2.1化合物和微藻种农药毒死蜱、三氯杀螨醇和乙草胺购自Dr.Eh-renstorfer GmbH(德国),其化学性质见表1.其余化学试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司(中国).微藻中肋骨条藻由厦门大学近海海洋环境科学国家重点表 1三种农药的理化性质农药名称CAS编号化学名称结构式LogKow水中的溶解度(mg L1,25)沸点()毒死蜱2921-88-2O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯3.781.4375.9乙草胺34256-82-12-乙基-6甲基-N-(乙氧甲基)-2-氯代乙酰替苯胺5.19223391.5三氯杀螨醇115-32-21,1-双(4-氯苯基-)2,2,2三氯乙醇4.280.8454.73中国科学:地球科学2023 年第 53 卷第 3 期645实验室海洋细菌与浮游植物收集中心提供.2.2中肋骨条藻的培养海水取自厦门沿海,用0.45m滤膜过滤两次,高温高压灭菌后用于制备/2培养基(Guillard和Ryther,1962).将中肋骨条藻以5104cells mL1的密度接种到培养基中,在20C及4500 Lx光强下培养,光暗周期为14h光照及10h黑暗.培养期间每天摇动三角瓶一次.通过检测细胞密度(cells mL1)和叶绿素a含量(Chl-a,mgL1)来分析培养期间中肋骨条藻的生长.所有实验均设有两次重复,实验数据为两次重复的平均值.2.3三种农药对中肋骨条藻的毒性效应2.3.1急性毒性分析利用培养实验分析了三种农药的单独急性毒性效应.培养实验是在250mL三角瓶中开展.将终浓度分别为0.1、0.3、0.4、0.5和0.6mg L1的毒死蜱,0.01、0.025、0.05、0.1和0.25mg L1的乙草胺,0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg L1的三氯杀螨醇添加至三角瓶中,用氮气吹干,以去除农药溶液中的甲醇,然后加入培养基.以不添加农药的培养作为对照.在接种中肋骨条藻24、48、72和96h后采集样品,分析细胞密度以监测微藻的生长.按照Berkson Logit法计算24、48、72和96h的半抑制效应浓度(EC50).通过公式(1)计算细胞生长速率Ut,UNNttlnln,(1)tt00其中,Ut是指在时间t(d)时的细胞生长速率(cells mL1d1);Nt和N0分别是在时间t和起始时间的细胞数量(cells mL1).用公式(2)计算细胞生长抑制率I(%)(epi等,2003),IUUU=100.(2)ctc其中,Uc和Ut分别是对照和处理在时间t的细胞生长速率(cells mL1d1).通过Logit变换将S形的量-效曲线转化为直线.用公式(3)计算浓度效应,IIABCLog100=+Log.(3)iii其中,Ii为处理组i中与农药浓度Ci(mg L1)对应的细胞生长抑制率(%).将回归方程进行F检验,p 1,=1.0.(4)ii150,1250,2350,350,其中,S是毒性效应的总和;Ci和EC50,i(i=1,2,3,.,n)分别表示混合物在半抑制效应时第 i 组分的浓度和第i个农药单独作用时的EC50值.通过计算AI值来评估农药的联合效应.AI0说明农药之间存在协同作用,AI0说明存在拮抗作用,AI=0说明存在相加作用.2.3.2慢性毒性分析Pikula等(2019)曾用生物柴油处理海洋微藻7天,以分析其慢性毒性效应.本研究在单个农药急性毒性分析的基础上,用各农药在96h EC50值的0.1、0.5和1.0倍的浓度处理中肋骨条藻16天(整个生长周期),以分析三种农药的慢性毒性效应.在培养期间,每天取样检测微藻的细胞密度及叶绿素a含量.2.4农药的降解以各个农药96h EC50值的0.1倍浓度作为初始浓度进行农药降解实验.在单个农药的降解实验中,各农药的初始浓度分别为毒死蜱0.0572mg L1、乙草胺张子莲等:农药对海洋微藻中肋骨条藻的毒性效应及其生物降解6460.014mg L1和三氯杀螨醇0.0430mg L1.在两种农药混合的降解实验中,各农药的初始浓度组合分别为毒死蜱0.0237mg L1和乙草胺0.0058mg L1、毒死蜱0.0405mg L1和三氯杀螨醇0.0304mg L1、乙草胺0.0080mg L1和三氯杀螨醇0.0245mg L1.在三种农药混合降解实验中,毒死蜱、乙草胺和三氯杀螨醇的初始浓度分别为0.0323、0.0079和0.0245mg L1.在培养期间检测各处理培养基中农药的浓度.2.5分析方法2.5.1细胞密度分析和细胞形态学观察为检测中肋骨条藻的细胞密度,取1mL培养液在其中加入20L Logul碘溶液以固定细胞,在显微镜(Leica DME B/CA,德国)下对细胞进行计数.Logul碘溶液是将1.0g碘和1.5g碘化钾溶解在装有25mL蒸馏水的棕色试剂瓶中制备而成.用乙草胺(0.01、0.025、0.05、0.1、0.25mg L1)处理中肋骨条藻96h后采样,在荧光显微镜(Axioskop40 FL,德国)下观察细胞形态.2.5.2叶绿素a含量分析取50mL中肋骨条藻培养液,用0.45m醋酸纤维素膜过滤收集细胞.用10mL丙酮(90%)从醋酸纤维素膜上的细胞中提取叶绿素a,最后用分光光度法分析培养液中叶绿素a的含量(Brand等,1981).2.5.3气相色谱-质谱法分析农药的浓度为了分析培养基中农药的浓度,在培养过程中不同时间点收集50mL培养液,并用GF/F过滤器(直径:47mm,孔径:0.7mm,450C下燃烧4h预处理)过滤.向滤液中加入25L浓度为5mg L1的替代标准品(磷酸