呕吐毒素降解菌A4的分离及降解特性研究_于阳光.pdf

农业环境科学学报Journal of AgroEnvironment Science2022，41（12）:2648-26592022年12月于阳光，胡俊强，王刚，等.呕吐毒素降解菌A4的分离及降解特性研究J.农业环境科学学报,2022,41（12）：2648-2659.YU Y G,HU J Q,WANG G,et al.Isolation and degradation characteristics of deoxynivalenol degrading strain A4J.Journal of Agro-Environment Science,2022,41（12）：2648-2659.开放科学OSID呕吐毒素降解菌A4的分离及降解特性研究于阳光1，2，胡俊强2，3，王刚1，2，高红侠2，邱涵2，3，张宇航2，刘馨1，2，史建荣1，2，徐剑宏1，2，3*（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业农村部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210014；3.南京农业大学生命科学学院，南京 210095）Isolation and degradation characteristics of deoxynivalenol degrading strain A4YU Yangguang1,2,HU Junqiang2,3,WANG Gang1,2,GAO Hongxia2,QIU Han2,3,ZHANG Yuhang2,LIU Xin1,2,SHI Jianrong1,2,XU Jianhong1,2,3*（1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.Jiangsu Key Laboratory for Food Qualityand Safety-State Key Laboratory Cultivation Base,Ministry of Science and Technology/Key Laboratory for Control Technology andStandard for Agro-product Safety and Quality,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Collaborative Innovation Center for Modern GrainCirculation and Safety,Nanjing 210014,China;3.College of Life Science,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China）Abstract：The purpose of this study was to isolate deoxynivalenol（DON）degrading strain and to evaluate its degradation characteristicsand mechanism,so as to provide strain resources for the detoxification of DON-contaminated grains and feeds.Soil samples were collectedfrom wheat fields contaminated with gibberella,and DON degrading bacteria were isolated through enrichment culture;they were identifiedby morphology and 16S rDNA,gyrB gene sequence.Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and nuclear magnetic resonance收稿日期：2022-11-08录用日期：2022-12-06作者简介：于阳光（1997），男，安徽宿州人，硕士研究生，从事毒素降解研究。E-mail：*通信作者：徐剑宏E-mail：基金项目：国家自然科学基金项目（32161143034，31872914，31901805）；国家重点研发计划项目（2018YFE0206000）；江苏省农业自主创新项目（CX（21）1005）；江苏省科技厅项目（BA2022034）；国家农产品安全风险评估项目（GJFP20220105，GJFP20220102）Project supported：The National Natural Science Foundation of China（32161143034，31872914，31901805）；The National Key Research and DevelopmentProgram of China（2018YFE0206000）；Jiangsu Agriculture Science and Technology Program（CX（21）1005）；The Jiangsu Province Science andTechnology Support Program（BA2022034）；National Special Project for Agro-product Safety Risk Evaluation of China（GJFP20220105，GJFP20220102）摘要：为了给呕吐毒素（DON）污染的谷物和饲料脱毒提供菌株资源，本研究从赤霉病污染区域的小麦田采集土壤样品，通过富集培养，分离筛选到一株DON降解菌，通过形态、16S rDNA、gyrB基因序列对降解菌进行菌种鉴定，液相色谱串联质谱和核磁共振鉴定降解产物，明确其降解途径和解毒机制，通过菌株生长特性、降解特性和基因组间差异分析比较DON降解菌A4、A8和A16之间的差异。结果表明：分离筛选获得DON降解菌A4，该菌能在10 h内降解9.7 gmL-1DON，降解率高达97%。经鉴定，A4为德沃斯氏菌（Devosia sp.）。A4通过降解DON为3-keto-DON进行脱毒。A4的最适生长温度为35，最适NaCl浓度为2%，其耐热性和耐盐性优于菌株A8和A16。A4的最适降解温度为35、最适降解pH为8.0，其降解速率高于菌株A8和A16。通过平均核苷酸相似度（ANI）分析，A4与A8和A16之间的ANI分别为81.54%和77.87%，均低于95%，因此属于不同种的菌株。研究表明，筛选得到的新型DON脱毒菌株A4具有良好的抗逆性，为DON的污染控制提供了新的降解菌资源。关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇；德沃斯氏菌；降解特性；基因组间差异分析中图分类号：X172文献标志码：A文章编号：1672-2043（2022）12-2648-12doi:10.11654/jaes.2022-1134于阳光，等：呕吐毒素降解菌A4的分离及降解特性研究2022年12月脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）又被称为呕吐毒素，其化学名称为12，13-环氧-3，7，15-三羟基单端孢霉-9-烯-8-酮，主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、蔷薇镰刀菌（Fusarium briar）和雪腐镰刀菌（Fusarium snow rot）等镰刀菌产生，是粮食、饲料和食品中主要的霉菌毒素之一1-4。DON 纯品为白色针状结晶，分子式为 C15H20O6，相对分子质量为 296.32，熔点为 151153，化学性质稳定5。DON 易溶于甲醇、乙腈和乙醇等极性溶剂，不溶于正己烷、丁醇、石油醚等弱极性溶剂，其毒性主要与12、13位的环氧基团，3位的羟基以及9、10位的双键有关6-7。DON具有急性毒性、慢性毒性、细胞毒性、免疫毒性、神经毒性等多种毒性，对人畜健康具有极大的危害8-9。研究发现，西班牙食品中DON的暴露量高，突出表现为在西班牙婴幼儿食品中 DON含量的超标10。随机采样检测发现阿根廷的小麦样品中DON的检出率较高11。MAHDJOUBI等12对阿尔及利亚市场上的谷物样品污染情况进行调查，发现DON是主要的霉菌毒素之一。通过对2018年至2020年我国各省饲料中DON含量进行调查，发现DON的检出率为96.4%，平均浓度为458.01 925.4 gkg-113。WANG等14对我国饮食中DON暴露情况进行研究，发现在采集的各类谷物样品中，小麦粉污染最为严重，DON平均浓度为250.8 gkg-1。陆晶晶等15从全国28个省（自治区、直辖市）取样，在5 678份小麦粉中，DON的检出率为 58.74%，超标率为 4.60%，平均含量为 317 gkg-1，含量范围为 056.1 mgkg-1。刘凤芝等16针对2017年上半年我国部分地区饲料及饲料原料中霉菌毒素的污染状况进行分析，发现 DON 超标率为51.8%。通过分析江淮流域的环境条件及小麦赤霉病的分布情况，发现气候条件对镰刀菌侵染小麦起主要影响作用17。DON在低pH和高温状态下不易被破坏，因此如何去除食品和饲料中的 DON 污染一直是研究的焦点18。生物降解法具有效率高、特异性强、对饲料和环境无二次污染等优点，是食品安全领域的研究热点。WANG等19报道了一株对DON、3-乙酰-DON和15-乙酰-DON具有降解能力的Devosia sp.A16，发现A16可将DON及其衍生物降解为3-keto-DON。徐剑宏等20报道了一株 Devosia sp.DDS-1可降解液体培养基中95%以上的DON，对小麦饲料中的DON毒素降解率也达到了75.47%。GARCA等21发现Lactobacillus rhamnosus RC007可降解DON，将其作为饲料添加剂可以降低DON对肠道的毒性。ZHANG等22报道了一株新的 DON 降解菌株 Nocardioides sp.ZHH-013，该菌可将 DON 代谢为 3-keto-DON 和 3-epi-DON。本实验拟从土壤中分离出一株可用于高效降解DON的菌株，明确菌株对DON的初步降解机制，验证其对DON的降解特性及其性能，并讨论其应用于实际生产的可能性。1材料与方法1.1 降解菌的分离与鉴定1.1.1 土壤样品与菌株土壤样品采集自宿州市、徐州市、淮安市三地受赤霉病污染的小麦田块。土样具体来源如表1所示。菌株 Devosia sp.A8 和 Devosia sp.A16 是实验室前期分离到的DON降解菌19-20，23。were used to identify degradation products,determine degradation pathways,and understand the detoxification mechanisms.Thedifferences between degrading bacteria A4 and DON degrading bacteria A8 and A16 were compared by analyzing strain growth anddegradation characteristics,and intergenomic differences.The degradation rate for the DON degrading bacteria,A4,was reported to be 9.7gmL-1which increased by more