欧李ChUFGT基因的克隆...生物信息学分析及亚细胞定位_王迪.pdf

分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 782-788 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,782-788研究报告Research Report欧李 ChUFGT 基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位王迪*成冠超*祝利伟刘宇涵笈小龙宋兴舜*东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040*同等贡献作者*通信作者,摘要为从分子水平上揭示欧李中 3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因的空间表达情况，以欧李叶片为试材，根据欧李的转录组序列设计特异性引物，通过 PCR 获得 ChUFGT 基因序列，并进行生物信息学分析及亚细胞定位分析。结果表明，ChUFGT 基因 DNA 开放阅读框为 1 425 bp(不含终止子)，相对分子质量为51.63 kD，编码 475 个氨基酸，其对应的蛋白质是带正电荷的稳定疏水性蛋白。与近缘物种的蛋白质序列比对分析显示，欧李、李和樱桃李的 UFGT 氨基酸序列相似度达到 97.22%和 96.62%，整个系统发育树存在两个大分支，其中 ChUFGT 与同科植物的亲缘关系最近，其次是与白梨、西洋梨、荔枝等其他科植物相对较近，与葡萄、刺葡萄、石榴等植物的亲缘关系最远。ChUFGT 的亚细胞定位结果分析显示，在洋葱内表皮细胞的细胞核和细胞质中都表达该基因。本研究结果为进一步阐明 ChUFGT 调控欧李细胞花色素苷的合成机制提供了理论基础。关键词欧李(Cerasus humilis);UFGT 基因;基因克隆;生物信息学分析;亚细胞定位Cloning,Bioinformatics Analysis and Subcellular Localization of ChUFGTGene from Cerasus humilisWang Di*Cheng Guanchao*Zhu LiweiLiu YuhanJi XiaolongSong Xingshun*College of Life Science,Northeast Forestry University,Harbin,150040*These authors contributed equally to this work*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.000782AbstractIn order to reveal the spatial expression of the 3-o-flavonoid glucosyltransferase(UFGT)gene in Cera-sus humilis at the molecular level,specific primers were designed according to the transcriptome sequence ofCerasus humilis,and the gene sequence was obtained by PCR,and the bioinformatics and subcellular localizationexpression analysis were carried out.The results showed that the open reading frame of ChUFGT gene was 1 425 bp(Without terminator),its relative molecular weight was 51.63 kD,encoding 475 amino acids.Its correspondingprotein was a stable hydrophobic protein with positive charge.Comparison with the protein sequences of relatedspecies showed that the similarity of UFGT amino acid sequences of Cerasus humilis,Prunus salicina and Prunuscerasifera reached 97.22%and 96.62%.There are two major branches of the phylogenetic tree,among whichChUFGT is the most closely related to plants of the same family,followed by white pear,western pear,litchi and基金项目：本研究由科技基础资源调查专项(2019FY100502-5)和东北林业大学国家级大学生创新训练项目(202010225037)共同资助引用格式：Wang D.,Cheng G.C.,Zhu L.W.,Liu Y.H.,Ji X.L.,and Song X.S.,2023,Cloning,bioinformatics analysis and subcellularlocalization of ChUFGT gene from Cerasus humilis,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):782-788.(王迪,成冠超,祝利伟,刘宇涵,笈小龙,宋兴舜,2023,欧李 ChUFGT 基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位,分子植物育种,21(3):782-788.)other other families,and is the most furthest to grape,thorn grape,pomegranate and other plants.The results ofsubcellular localization analysis showed that the ChUFGT was expressed in both the nucleus and cytoplasm ofonion inner epidermal cells.The results of this study was to further clarify ChUFGT regulation Cerasus humiliscells anthocyan nucleoside synthesis mechanism provides a theoretical basis.KeywordsCerasus humilis;UFGT gene;Gene cloning;Bioinformatics analysis;Subcellular localization欧李(Cerasus humilis)作为中国特有的蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)多年生小灌木，主要分布在东北、华北地区(李霞,2012,山西水土保持科技,(2):47-48)。欧李叶片形状呈倒卵椭圆，上面呈深绿色，下面呈浅绿色；花瓣呈粉白色倒卵形；成熟果实呈紫红色球状，气味浓香，色泽鲜艳。欧李能适应水分胁迫(温鹏飞,2006,园艺学进展,(7):26-30)，可在旱地栽种(赵明优和李永录,2020)，能保持水土(贾永国等,2018)，甚至能改善矿渣土质(母冰洁等,2019)；富含氨基酸和多酚(刘淑琴等,2009)，具有抗氧化性，钙含量高，可加工为酒水饮料和钙片(顾飞,2016)。植物器官的呈色主要与花青素等物质有关(Konget al.,2008)，3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)是花青素合成相关基因之一(Kim et al.,2003;丁体玉等,2017;王军和于淼,2010)。植物组织中花青素的含量与 UFGT 基因表达量有关(Honda et al.,2002;韩振云等,2014)，UFGT 通过将糖部分附着在花青素苷元上来稳定花青素(Li et al.,2016)，促进花青素的积累，表现为较高水平的 UFGT 表达会相应积累较多的花青素。有研究者利用香草醛(VA)诱导内源 ABA 上调花青素积累相关基因 UFGT 等的表达，以此发现了改善葡萄草莓等果实着色的可能性(Enoki et al.,2017)。而 UFGT 基因的表达水平降低会相应地延缓果皮中的色素沉着(Lister et al.,1996)，在许多红色葡萄品种中 UFGT 仅在浆果皮中表达，使花青素积累在浆果皮中，而白色葡萄品种的果皮因为缺乏 UFGT 的表达导致花青素的缺乏(Boss et al.,1996)。目前，UFGT 基因虽在多种植物中有报道(Kobayashi et al.,2001;张洪伟等,2015;孟富宣等,2016;招雪晴等,2017;杜丽娜等,2019;赖呈纯等,2019)，但在矮生经济灌木林中还鲜有研究。本实验以欧李为植物材料，克隆获得 ChUFGT 基因片段后，进行生物信息学分析，并研究其亚细胞定位表达情况，以期后续揭示欧李 ChUFGT 基因调控其花青素的合成机制。1结果与分析1.1目的基因的克隆根据课题组前期获得的欧李基因组序列(PRJ-NA636897)，设计特异性 PCR 引物，以欧李总基因组cDNA为模板进行 PCR 获得 ChUFGT 基因片段(图 1)，分析实验结果发现基因序列长度为 1 425 bp，编码475 个氨基酸。1.2 ChUFGT基因编码的蛋白的生物信息学分析ChUFGT 编码 475 个氨基酸，分子量为 51.63 kD，蛋白质的等电点理论值为 6.57，脂肪系数为 94.84，亲水指数为 0.068，不稳定指数为 38.98，分子式为C2326H3657N623O671S17，包含 7 294 个原子，根据预测ChUFGT 基因编码的蛋白是稳定的疏水性蛋白。利用Protscale 网站验证该蛋白的亲疏水性，分析结果表明(图 2A)，最强的亲水值为-2.867，最强的疏水值为1.889，符合上述预测结果。ChUFGT 编码的蛋白质包含四种二级结构，其中-螺旋(Alpha helix)比例为38.11%、延伸链(Extended strand)的比例为 16.00%、-转角(Beta turn)的比例为 4.84%、无规则卷曲(Random coil)的比例最多，为 41.05%(图 2B)，并预测 ChUFGT 蛋白质三级结构(图 2C)。使用 ClustalX2进行多序列比对，结果显示(图 3)，欧李 ChUFGT 基因编码的蛋白质序列与桃(Prunus persica,XP_007217-952.1)、扁桃(Prunus dulcis,XP_034203307.1)、李(Pru-nus salicina,AMD39598.1)、梅花(Prunus mume,XP_008234582.1)、石榴(Punica granatum,QCO95449.1)、刺葡萄(Vitis davidii,AUT13180.1)、樱桃李(Prunuscerasifera,AKV89253.1)、葡萄(Vitis vinifera,ABF59-818.1)、荔枝(Litchi chinensis,ADO95203.1)、欧洲大樱桃(Prunus avium,AJO67982.1)、欧洲酸樱桃(Prunus图 1 ChUFGT 基因片段扩增检测注:M:DL2000 DNA Marker;1:ChUFGT 片段Figure 1 Amplification of ChUFGT gene fragmentNote:M:DL2000 DNA Marker;1:ChUFGT segment欧李 ChUFGT 基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位Cloning,Bioinformatics Analysis and Subcellular Localization of ChUFGT Gene from C