皮肌炎患者肌肉组织中Mcl...a蛋白的表达情况及临床意义_严丽芳.pdf

论著临床研究基金项目：青海省科技计划项目（）第一作者简介：严丽芳，硕士，副主任医师，研究方向：风湿病学。通信作者简介：柴克霞，硕士，主任医师，教授，研究方向：风湿病学。皮肌炎患者肌肉组织中 蛋白、蛋白的表达情况及临床意义严丽芳 柴克霞（青海大学附属医院风湿免疫科，青海省西宁市）【摘要】目的 分析皮肌炎患者肌肉组织中髓样细胞白血病（）蛋白和 蛋白的表达水平，并探讨两者在皮肌炎发生和发展中的临床意义。方法采用免疫组化法检测 例皮肌炎患者（皮肌炎组）及 例行清创术的单纯骨科外伤患者（对照组）的肌肉组织中 蛋白、蛋白阳性表达率及光密度值。分析 蛋白、蛋白的光密度值与皮肌炎患者临床病理特征、肌酸激酶（）水平、血沉及疾病活动度的关系。结果（）皮肌炎组肌肉组织中 蛋白的阳性表达率和光密度值均高于对照组，蛋白的阳性表达率和光密度值均低于对照组（均 ）。（）与无间质性肺疾病、水平正常、血沉正常的皮肌炎患者相比，合并间质性肺疾病、水平升高、血沉升高的患者肌肉组织中 蛋白光密度值更高，而 蛋白光密度值更低（均 ）。（）皮肌炎组患者肌肉组织中 蛋白光密度值与 水平、血沉、总体疾病活动度评分、肌肉疾病活动度评分、肺脏疾病活动度评分均呈正相关，蛋白光密度值则与上述指标均呈负相关（均 ）。结论 皮肌炎患者肌肉组织中 蛋白表达上调，蛋白表达下调，两者与皮肌炎的发生、疾病活动度、炎症反应程度、并发间质性肺疾病均密切相关。【关键词】皮肌炎；髓样细胞白血病 蛋白；蛋白；疾病活动度；炎症反应；间质性肺疾病【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，）【】（），（），（），（），（），（）（），（）（），（），【】，皮肌炎是炎性肌病最常见的亚型之一，是一种临床异质性较高的自身免疫性疾病，通常以皮疹、近端骨骼肌无力、血清肌酸激酶升高及大量炎症细胞浸润为其主要临床特点。皮肌炎的发病机制复杂，目前认为与遗传、炎症反应、细胞凋亡、自噬、细胞焦亡等因素相关。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡，是生命体维持细胞数量动态平衡的基本现象，其出现障碍可引起肿瘤和自身免疫性疾病。研究发现，线粒体凋亡是细胞凋亡的主要途径，其过程主要由 细胞淋巴瘤 蛋白家族参与，而髓样细胞白血病（，）蛋白是这一家族中唯一含有增殖细胞核抗原结构的蛋白分子，是调控凋亡的关键上游分子，这一家族中的另一成员 蛋白能特异性地与 蛋白结合，从而起到促凋亡作用，二者均参与机体细胞凋亡平衡机制。研究表明，蛋白、蛋白的异常表达可以调控各种肿瘤、神经退行性疾病、感染、传染病及自身免疫性疾病的发生和发展。然而，国内外尚无关于 蛋白、蛋白在皮肌炎中的研究。目前国内外常采用肌炎活动视觉模拟评估量表（，）来评估皮肌炎患者的疾病活动度。本研究通过检测皮肌炎患者肌肉组织中的 蛋白、蛋白的表达水平，研究其与皮肌炎患者疾病活动度之间的关系，进一步探讨 蛋白、蛋白在皮肌炎发生和发展中的临床意义，为皮肌炎的病情评估提供一定的依据。资料与方法 临床资料 选取 年 月至 年 月在青海大学附属医院风湿免疫科确诊的 例皮肌炎患者作为皮肌炎组，以及同时期在该院因单纯骨科外伤行清创术的 例患者作为对照组。皮肌炎组纳入标准：诊断均符合 年欧洲抗风湿病联盟和美国风湿病学会提出的成人特发性炎性肌病分类标准；未经治疗的初诊皮肌炎患者；由骨外科会诊行肌肉活检。对照组纳入标准：既往体健；无皮肌炎病史。两组排除标准：肌营养不良、横纹肌溶解、药物和毒物诱导的肌病、神经肌肉疾病、代谢类疾病、内分泌类疾病、过敏性疾病、肿瘤性疾病患者。皮肌炎组患者中，男性 例、女性 例，年龄 （）岁；合并间质性肺疾病（，）例（），合并关节痛 例（），合并吞咽困难 例（）；肌酸激酶（，）水平升高者 例（），血沉升高者 例（）；行肌炎特异性抗体检测 例，其中抗黑色素瘤分化相关基因（，）抗体阳性 例（）。对照组中，男性 例、女性 例，年龄（）岁。两组的年龄、性别差异均无统计学意义（均 ）。本研究已通过青海大学附属医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。研究方法 肌肉组织石蜡切片的制作：取皮肌炎组患者病变累及的肱三头肌或股四头肌组织（），取对照组研究对象单纯骨科外伤部位旁的正常肌肉组织（）。所有肌肉组织标本均用 的福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋、制片，以备行免疫组织化学染色。肌肉组织中 蛋白、蛋白表达的检测：采用免疫组化 二步法进行检测。切片脱蜡水化后，用 封闭内源性过氧化物酶；加一抗蛋白一抗（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：）工作浓度为 ，蛋白一抗（公司，货号：）工作浓度为 ，孵育 ；复合物（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：）孵育 ；水洗，复染，常规树胶封片，光学显微镜（公司，型号：）下观察。蛋白、蛋白主要表达于细胞胞浆，少广西医学 年 月第 卷第 期数表达于细胞核，阳性染色呈棕黄色或棕褐色颗粒。免疫组化阳性结果的判定：每张切片先在 倍镜下选取细胞密集区域，再用 倍镜拍照。（）参照文献中的标准进行免疫组化阳性结果判定。首先根据着色强度进行评分，无色评为 分，淡黄色评为 分，棕黄色评为 分，棕褐色评为 分。再根据染色呈阳性的细胞所占的百分比进行评分，无阳性细胞评为 分，阳性细胞占比评为 分，占比为 评为 分，占比为 评为 分，占比 评为 分。最后将着色强度评分与阳性细胞占比评分相乘，得分 分评为阳性，分评为阴性。（）使用组织切片数字扫描仪采集免疫组化切片上的图像，通过 软件自动读取组织测量区域，测量光密度值。所有病理切片的阅片均由 名经验丰富的病理专科医师采用双盲法完成，两者阳性结果判读一致的切片才用于本研究分析。皮肌炎疾病活动度的评估：采用 评估皮肌炎患者的疾病活动度。该量表包括患者的一般情况，皮肤黏膜、骨骼系统、胃肠道、心血管、肺脏、肌肉疾病活动度，以及总体疾病活动度 个方面，共 个项目，采用视觉模拟评分法（分）来评估每一方面的活动度，其中 分代表无活动，分代表中度活动，分代表极度活动，评分越高，疾病活动度越强，器官损伤程度越严重。本研究重点对总体疾病活动度、肌肉及肺脏的疾病活动度进行分析。统计学分析 采用 软件进行统计学分析。计量资料以（）表示，组间比较采用两独立样本 检验；计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用 检验；正态分布的计量资料采用 检验进行相关性分析，分类资料采用 秩相关检验进行相关性分析。以 表示差异具有统计学意义。结 果 两组患者肌肉组织中 蛋白、蛋白表达情况的比较 皮肌炎组肌肉组织中 蛋白的阳性表达率和光密度值均高于对照组，而 蛋白的阳性表达率和光密度值均低于对照组（均 ）。见表、图。表 两组患者肌肉组织中 蛋白和 蛋白表达情况的比较组别 蛋白阳性表达率（）光密度值（）蛋白阳性表达率（）光密度值（）皮肌炎组（）（）对照组（）（）值 值 图 两组 蛋白和 蛋白的表达情况（免疫组化染色，）注：、分别为对照组、皮肌炎组 蛋白表达情况；、分别为对照组、皮肌炎组 蛋白表达情况。蛋白、蛋白光密度值与皮肌炎患者临床病理特征的关系 蛋白、蛋白的光密度值与皮肌炎患者的关节痛、吞咽困难症状及抗 抗体水平均无关（均 ）；与无 患者相比，合并 的患者肌肉组织中 蛋白光密度值更高，而 蛋白光密度值更低（均 ）；与 水平正常患者相比，水平异常升高患者肌肉组织中 蛋白光密度值更高，蛋白的光密度值更低（均 ）；与血沉正常患者相比，血沉升高患者肌肉组织中的 蛋白的光密度值更高，而 蛋白的光密度值更低（均 ）。见表。，表 不同临床病理特征的皮肌炎患者 蛋白、蛋白光密度值的比较（）指标 蛋白 值 值 蛋白 值 值关节痛 无 有 吞咽困难 无 有 合并 情况 无 有 水平 升高 正常 血沉 升高 正常 抗 抗体 阳性 阴性 注：仅 例患者同意行肌炎特异性抗体检测。蛋白、蛋白光密度值与皮肌炎患者 水平、血沉的相关性皮肌炎组患者肌肉组织中 蛋白光密度值与 水平、血沉（赋值均为正常、升高）均呈正相关（、，、），蛋白光密度值与 水平、血沉（赋值均为正常、升高）均呈负相关（分别 、，）。蛋白、蛋白光密度值与皮肌炎患者疾病活动度的相关性皮肌炎组患者的总体疾病活动度评分为 （）分，肌肉疾病活动度评分为 （）分，肺脏疾病活动度评分为（）分；蛋白的光密度值与皮肌炎患者的总体疾病活动度评分、肌肉疾病活动度评分、肺脏疾病活动度评分均呈正相关（均 ）；蛋白的光密度值与皮肌炎患者的总体疾病活动度评分、肌肉疾病活动度评分、肺脏疾病活动度评分均呈负相关（均 ）。见表。表 皮肌炎患者 蛋白、蛋白的光密度值与疾病活动度的相关分析指标总体疾病活动度评分 值 值肌肉疾病活动度评分 值 值肺脏疾病活动度评分 值 值 蛋白 蛋白 讨 论 研究发现，皮肌炎患者束周萎缩处存在肌细胞线粒体功能障碍和线粒体凋亡途径分子的表达，由此推测线粒体凋亡途径分子参与了皮肌炎的发生和发展。而抗凋亡蛋白 蛋白和促凋亡蛋白 蛋白是线粒体凋亡途径的重要成员，可能也参与皮肌炎的发生和发展。自 等在 细胞系中发现 蛋白基因以来，大量研究 表明 蛋白在许多细胞的死亡和生存调控程序中起着关键作用，尤其是对 淋巴细胞、淋巴细胞的功能维持起到重要作用，而皮肌炎患者肌损伤处局部浸润的淋巴细胞主要为 淋巴细胞和 淋巴细胞，这提示 蛋白对于皮肌炎进展的研究具有一定的价值。目前，已有关于 蛋白、蛋白与某些自身免疫性疾病之间关系的研究，如类风湿关节炎和干燥综合征，其中有关类风湿关节炎的研究显示，由于 蛋白的表达下调及 蛋白的表达上调，类风湿关节炎患者的滑膜间隙成为一个有效的抗凋亡环境，导致自身反应性 淋巴细胞被慢性激活，淋巴细胞凋亡减少，从而引起 淋巴细胞在滑膜间隙过度集聚，导致滑膜炎症持续存在。另外，有学者发现，在狼疮小鼠中应用 蛋白促进剂，可以促进广西医学 年 月第 卷第 期 淋巴细胞的凋亡；在干燥综合征患者和干燥综合征合并淋巴瘤患者中，应用 蛋白促进剂及 蛋白拮抗剂，可以促进 淋巴细胞凋亡，从而改善病情。这些研究都提示 蛋白、蛋白在自身免疫疾病的炎性反应、免疫反应中起着重要作用。但二者与皮肌炎之间的关系，尚无研究报告。本研究结果提示，皮肌炎组患者肌肉组织中蛋白表达水平高于对照组，且与 水平及皮肌炎总体疾病活动度评分、肌肉疾病活动度评分、肺脏疾病活动度评分均呈正相关（均 ）；而皮肌炎组患者肌肉组织中 蛋白表达水平低于对照组，且与 水平及皮肌炎总体疾病活动度评分、肌肉疾病活动度评分、肺脏疾病活动度评分呈负相关（均 ）。这表明 蛋白的表达上调及 蛋白的表达下调与皮肌炎的发生及病情严重程度有关。结合上述研究结果，我们推测 蛋白、蛋白可能通过线粒体凋亡途径参与皮肌炎发病过程，当抗凋亡蛋白 蛋白表达水平升高，促凋亡蛋白 蛋白表达水平降低时，可能导致肌肉组织内大量 淋巴细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞持续存在，尤其是 淋巴细胞和 淋巴细胞大量被激活并发挥作用，导致机体炎症及免疫反应增强，体内产生大量自身抗体，从而促使皮肌炎发生，并可导致病情加重。本研究结果还显示，与血沉正常患者相比，血沉升高患者肌肉组织中的 蛋白的光密度值更高，而 蛋白的光密度值更低；皮肌炎组患者血沉与 蛋白表达水平呈正相关，而与 蛋白表达水平呈负相关（均 ）。血沉是反映炎症程度的可靠指标，因此上述结果说明 蛋白及 蛋白表达水平与皮肌炎的炎症反应程度密切相关。此外，本研究中，与未合并 的皮肌炎患者相比，合并 的皮肌炎患者肌肉组织中的 蛋白表达水平更高，蛋白表达水平更低（均 ）。有学者发现皮肌炎患者是否发生 与肌肉局部炎症密切相关。等的研究也表明，选择性表达 基因片段的 淋巴细胞积聚在皮肌炎患者的肺脏和肌肉组织，提示肺脏可能存在共同靶抗原，淋巴细胞通过识别这些靶抗原参与皮肌炎的发病过程，皮肌炎患者肌肉组织局部炎症反应越明显，肺部的免疫炎症反应也会越明显。目前已有研究证实，合并 的皮肌炎患者血清中存在大量特异性自身抗体，如抗 抗体等，这些抗体本身可以作为细胞因子进一步趋化 淋巴细胞、淋巴细胞等免疫细胞，募集炎症介质使炎症过程持续存在，故合并 的皮肌炎患者的免疫炎症反应更明显。综上所述，皮肌炎患者肌肉组织中 蛋