苹果果实褐腐病病原菌分离鉴定_吕昭龙.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(3):4 8 8-4 9 4A c t aA g r i c u l t u r a eB o r e a l i-o c c i d e n t a l i sS i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 7h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 3.0 1 7苹果果实褐腐病病原菌分离鉴定收稿日期:2 0 2 2-0 1-1 8 修回日期:2 0 2 2-0 2-0 1基金项目:甘肃省农业科学院重点研发计划(2 0 2 1 GAA S 0 7);国家苹果产业技术体系(C A R S 2 7)。第一作者:吕昭龙,男,硕士研究生,研究方向为植物病害及其综合防治。E-m a i l:g s l v z l 1 6 3.c o m通信作者:李继平,男,研究员,研究方向为植物病害及其综合防治。E-m a i l:g s l i j p 1 6 3.c o m王森山,男,教授,研究方向为植物保护。E-m a i l:w a n g s e n s h a ng s a u.e d u.c n吕昭龙1,2,蒋晶晶1,3,李继平1,2,3,翟艳青2,惠娜娜1,3,王 立1,3,马生彪1,郑 果1,2,3,漆永红1,3,王森山2(1.甘肃省农业科学院 植物保护研究所,兰州 7 3 0 0 7 0;2.甘肃农业大学 植物保护学院,兰州 7 3 0 0 7 0;3.农业部天水作物有害生物科学观测试验站,甘肃天水 7 4 1 2 9 9)摘 要 为明确甘肃省静宁县苹果果实褐腐病病原菌种类,对采自该地区苹果果实褐腐病病原菌种类进行鉴定。通过组织分离法将菌株分离纯化后,采用柯赫氏法则进行致病性验证,结合形态学特征和内转录间隔区基因(I n t e r n a lT r a n s c r i b e dS p a c e r,I T S)、-微管蛋白基因(-T u b u l i n,TU B 2)和L a c c a s e(L c c 2)多基因的系统发育分析以及常规P C R测定对分离菌株进行鉴定。结果表明,分离菌株为云南链核盘菌(M o n i l i ay u n-n a n e n s i s),可同时侵染不同品种果实,致病性结果显示对 秦冠 富士 新红星 有致病性,而对 嘎啦 致病性较弱。关键词 苹果;云南链核盘菌;褐腐病 苹果属于蔷薇科(R o s a c e a e)苹果属(M a l u ss p p.),是中国主要的栽培水果之一。根据联合国粮食及农业组织的数据,2 0 1 8年中国苹果种植面积达到2 0 7万h m21。但近年来,由于苹果褐腐病的发生危害,严重影响了果实品质和出口效益,造成了严重的经济损失2。据文献报道,褐腐病在核果类和仁果类果实上常有发生,由链核盘属真菌(M o n i l i n i as p p.)感染引起,主要危害植物的花、芽、枝和果实,尤其是接近成熟期、收获期和贮藏期的果实3。褐腐病在世界范围内广泛分布,其 中 澳 大 利 亚、亚 洲、美 洲 和 欧 洲 危 害 最大4-6。中国已有1 6个省有褐腐病的发生。据报道,引起苹果褐腐病的病原菌是M o n i l i n i as p p真菌中亲缘关系最密切的6个种,即:果生链核盘菌(M o n i l i n i af r u c t i c o l a)7,核果链核盘菌(M.l a x a),产核链核盘菌(M.f r u c t i g e n a),梅生链核盘菌(M.m u m e c o l a)8,云南链核盘菌(M o n i l i ay u n n a n e n s i s)和 聚 子 座 链 核 盘 菌(M.p o l y s t r o-m a)。静宁县地处北纬3 5 的黄土高原暖温带半湿润气候区,土层深厚,光热资源丰富,年均温度、降雨量、日照时数等气候条件非常适宜苹果生长,是世界公认的苹果“黄金生产带”,苹果种植面积超过6.6 6万h m2,是甘肃苹果主产区之一,“静宁苹果”是甘味食品的重要品牌,凭借优质品质与品牌效应,静宁苹果畅销全国,甚至远渡重洋出口国外。苹果褐腐病的发生为害,不仅造成果实腐烂,果农受损,甚至还会影响到市场销售及其品牌9。然而,目前还没有关于苹果褐腐病病原菌种类的报道。本研究通过对甘肃省静宁县苹果果实褐腐病病原菌的鉴定,明确病原菌种类,为苹果褐腐病防治和当地苹果产业的发展提供科学依据。1 材料与方法1.1 试验材料2 0 2 0年1 0月于甘肃省静宁县采集发病的 秦冠 苹果果实褐腐病样品,装入自封袋中于4冰箱内保存。选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(P o t a t od e x t r o s ea g a r,P D A)用于病菌的分离纯化和 培养。1.2 苹果褐腐病发病部位菌株的分离采用组织分离法分离苹果褐腐病发病部位的菌株。先将样品用无菌蒸馏水冲洗并晾干。使用灭菌 的 解 剖 刀 在 苹 果 果 皮 病 健 交 界 处 切 下4mm4 mm的 组 织 块。将 组 织 块 浸 入5%N a C l O中9 0s,然后用无菌蒸馏水冲洗3次。再将其放入7 5%乙醇中4 0s进行消毒,然后用灭菌蒸馏水冲洗3次。用灭菌镊子将消毒后的组织块放置在无菌滤纸上,晾干后放在P D A上,2 5避光培养3d后,挑取单个菌落的菌丝,转移到新的P D A上,2 5暗培养7d,备用。1.3 苹果褐腐病发病部位分离菌株形态学观察菌落形态:在P D A培养基上生长7d后观察待测纯化菌株的菌落特征,包括菌落正面和反面的颜色,气生菌丝的情况,菌落边缘的形状,菌落的质地 等,采 用 十 字 交 叉 法 测 定 菌 落 直 径,并记录。显微形态:将待测纯化菌株在P D A平板上培养产孢,对于不产孢的菌株,采用菌落划伤法、液体摇培等方法进行诱导产孢。将产生的分生孢子、分生孢子盘等结构置于载玻片上,以无菌水做浮载剂,在显微镜下观察其结构特征,对于菌丝、产孢结构、分生孢子等形态特征进行拍照和记录描述,随机选取3 0个分生孢子,测量分生孢子的大小。1.4 苹果褐腐病分离菌株分子生物学测定采用真菌基因组D NA提取试剂盒(Om e g a)提取病原菌D NA,用于P C R反应的引物信息见表1。P C R反应体系总体积为2 5L,包含2T a qM a s t e r M i x1 2.5L,正反向引物各0.5L(1 0m o l/L),D NA模板1L,以d d H2O补足至2 5L。反应条件为:9 5预变性5m i n;9 5变性3 0s,5 5退火4 5s,7 2延伸4 5s,共3 5个循环;最后7 2延伸1 0m i n。取5L上述P C R扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳(U:1 1 0V)进行检测后将P C R产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。将测得的基因序列与G e n B a n k中的序列进行比对,下载相似性高的序列及其对应复合种的常见模式菌株序列,使 用ME GA 7.0软 件 剪 切 后 按 照I T S-TU B 2-L c c 2的顺序首尾拼接,分析系统发育关系,采用邻接法(N e i g h b o r-j o i n i n g,N J)构建系统进化树,以自展法(B o o t s t r a p)进行检测,共循环10 0 0次,得到系统发育树。表1 用于苹果褐腐病鉴定的引物信息T a b l e1 P r i m e r su s e d i nt h i s s t u d y引物名称P r i m e r引物序列(5 3)P r i m e r s e q u e n c e参考文献R e f e r e n c e sI T S 1T C C G T A G G T GAA C C T G C G G1 0I T S 4T C C T C C G C T T A T T GA T A T G C1 0B t 2 aG G T AA C C AAA T C G G T G C T G C T T T C1 1B t 2 bA C C C T C A G T G T A G T GA C C C T T G G C1 1L a c a FG C A T C T G C A T C T G C T A T T C C A G C T7L a c a RC T T A C C G C C A C C AA C G C A G T T7C l a FG G T AA G C GA C A T C G C A T T C T C A C7C l a RGA G G T AAA T G T G G T AAAT A T G C A G7L l a FC C A C T C C T T C AAAT A C C A C T T7L l a RG C T A GA C T G G T A C AAAA G GA T G T T T7G p l a FC C A C T T C C AA C A T C A C T C7G l a RG T AAA G G T G G C G T AA T T T T G GA T T7P l a RC C C A GA T T T C AAAA G C G GAT T C7G c l a FC C A C T T C T T C GAA T AA C A7G c l a RG G T T C C G T A T T GA G T AA C T T T A71.5 苹果褐腐病分离菌株致病性测定用刺伤菌丝接种法进行致病性测定。在P D A上培养待测菌株5d后,在菌落边缘打孔(5mm),待用。选择生长健康的 富士 秦冠 新红星 和 嘎啦 苹果果实作为接种材料。首先将苹果清洗干净,晾干,再用7 5%酒精消毒,然后用无菌水冲洗3次。用无菌铁钉(5mm)刺破苹果表面后,将菌丝块接入伤口处,接种无菌P D A培养基作为阴性对照(C K)。将接种后的苹果果实密封并保存在2 5 的培养箱中。每个处理重9843期吕昭龙等:苹果果实褐腐病病原菌分离鉴定复9次,接种后每天观察发病情况并记录病斑扩展直径(D)。结果分别确定为弱致病性(D2 7.5mm)、中度致病性(2 7.5mmD4 0mm)。对于接种后发病的样本,采用组织分离法再次分离病原菌,并与原分离菌进行比较。2 结果与分析2.1 苹果褐腐病分离菌株形态学鉴定苹果褐腐病症状表现为果实的表面会发生腐烂(图1-A和1-B)。发病部位呈黄褐色。严重时呈黑色,有发酵气味,使果实无法食用,影响果实品质和经济效益。从2 1份样品中分离出的3 2份菌株均为同一类型,命名为P GH F。菌株P GH F在P D A培养基上生长7d后(图1-C和1-D),菌落直径为8 5mm,边缘整齐、圆形,表面蓬松,气生菌丝的正面和背面是白色的。分离株在培养基上生长3 0d后(图1-E和1-F),气生菌丝贴在在培养基表面生长,菌落产生大小和形状不同的深褐色基质。在显微镜下观察,菌丝无色透明,有隔膜,分生孢子梗直接由菌丝发育而来。分生孢子呈珠状,有分枝或单枝(图1-G和1-H)。分生孢子呈黄棕色、柠檬形或纺锤形,大小为7.7 3m1 0.8 3m1 2.5 2m1 9.9 7m(图1-I)。根据形态特征观察,判断分离菌株与云南链核盘菌(M o n i l i ay u n n a n e n s i s)相似。A和B.果实褐腐病症状;C和D.在P D A上生长7d的菌落;E和F.在P D A上生长3 0d的菌落;G和H.分生孢子梗和分生孢子;I.分生孢子。标尺表示2 0mAa n dB.S y m p t o m so fb r o w nr o t o n f r u i t s;Ca n dD.C o l o n i e s g r o w