明胶基抗菌水凝胶的制备与表征_杨明涛.pdf

明胶基抗菌水凝胶的制备与表征杨明涛，田珊珊，吴志军，刘临（宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 ）摘要：以明胶为基体，乙烯基吡咯烷酮（）为改性单体，在引发剂作用下通过原位聚合将聚乙烯基吡咯烷酮（）分子接枝于明胶分子骨架。然后通过物理吸附和化学键合的方式将碘分子负载到复合水凝胶中，制备明胶基抗菌水凝胶。重点探究了不同单体加入量下 的接枝率、相关条件下复合水凝胶的凝胶强度、细胞毒性及碘分子负载量，并对负载碘分子的水凝胶抗菌性进行了分析表征。结果表明：测试证实了 在明胶骨架上发生了接枝反应；浓度大小影响接枝分率，在一定条件下 浓度为 时接枝分率最高为 ；室温下，接枝分率 的 导致明胶水凝胶强度降低，但当接枝分率高于 时，凝胶强度增大到与纯明胶相当，与 时进行对比分析，说明 产生的化学网络对提高高温下的明胶强度很关键；碘分子在 明胶复合体系中虽然总负载变化不大，但化学负载量随接枝分率增加而增加，有利于水凝胶在较高温度下的形态稳定；负载了碘分子的复合水凝胶对金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制行为。关键词：明胶；乙烯基吡咯烷酮；碘；凝胶强度；抗菌中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：（）（）（），：；碘是一种有效的抗菌剂，然而其毒性、刺激性和生理活性限制了其在生物医学领域的应用。将碘附着在功能化的聚合物上缓慢释放可以减少这些弊端，其中已被广泛使用的聚维酮碘（）复合物已被证明在皮肤消毒、治疗各种类型的感染和潜在感染伤口方面十分有效。但 复合物会导致创面干燥和表面焦痂形成，用载药水凝胶湿润创面治疗比干燥治疗更早导致浅表皮肤创面上皮化，如 等用碘载水凝胶作烧伤敷料引起了广泛关注，等人制备了 水凝胶负载碘以制备自调节第 卷第 期 年 月宜春学院学报 ，收稿日期：作者简介：杨明涛（），女，湖北松滋人，讲师，博士，研究方向为高分子材料的合成与加工。释药系统。明胶是从动物皮、骨、结缔组织等得到的胶原的分解产物，属于天然大分子材料且来源充足，良好的生物相容性是其自身的优势属性，近年来在生物医用领域的应用研究活跃，尤其是作为药物传递的载体方面。明胶在较低温度下形成凝胶网络，具有一定的持水性，保证了作为湿润治疗的基础。但随着温度升高，明胶在水中的溶解度增大，只具有物理网络的水凝胶强度会大大降低，在体液环境下使用其材料强度和形态稳定性大打折扣。因此本文将明胶首先接枝聚乙烯基吡咯烷酮，在水凝胶中产生化学网络，以提高明胶水凝胶在较高温度使用时的强度，同时利用聚乙烯基吡咯烷酮对碘的强结合作用引入碘，制备可用于皮肤创口治疗的明胶基抗菌水凝胶，并对其性能进行表征，为后期进一步研究其药物释放规律奠定基础。实验部分 试剂与设备明胶（，），乙烯基吡咯烷酮（，），偶氮二异丁腈（，天津大茂化学试剂厂），三氯甲烷（，成都科隆化学品有限公司），丙酮（，西陇化工），碘（，上海泽叶生物有限公司），碘化钾（，山东信恒化工有限公司），金黄色葡萄球菌（，菌种保藏中心北纳生物），小鼠胚胎成纤维细胞（，上海钰博生物科技有限公司）。冷冻干燥机（，赛飞中国有限公司），傅里叶红外光谱仪（，德国 ），流变仪（，美国），酶标仪（，美国 ），集热式恒温加热磁力搅拌器（，巩义市予华仪器有限责任公司），双人垂直送风洁净工作台（型，苏州安泰空气技术有限公司），细胞培养箱（二氧化碳培养箱，上海巴艾贝斯生物科技有限公司）。实验方法 实验过程明胶基抗菌水凝胶制备步骤如图所示。首先，将明胶与乙烯基吡咯烷酮（）混合，在引发剂，偶氮二异丁腈（）作用下，在明胶分子骨架上原位反应，明胶接枝聚 乙烯基吡咯烷酮（）大分子链。然后，将接枝明胶配制成水凝胶，模塑成型，冷冻干燥得到孔隙结构明胶材料。最后，孔隙结构明胶用碘水溶胀，制成明胶基抗菌水凝胶。图 明胶基抗菌水凝胶制备步骤示意图 接枝明胶的制备 接枝明胶的制备过程参照文献 进行。详细过程如下：用量筒量取 蒸馏水至三颈烧瓶中，磁力搅拌，设定转速为 。向三颈瓶缓慢通入氮气，并将蒸馏水加热至 ，稳定 。称取明胶 投入三颈烧瓶中，溶解 。依次称取一定量单体 和引发剂 快速溶于 水，并加入到三颈烧瓶中。氮气环境下反应。所得产物用 丙酮沉淀，抽滤，下真空干燥。所得产品用滤纸包裹好，置于索氏抽提器中，用 三氯甲烷在 回流，除去明胶体系中的均聚 ，得到 接枝明胶。接枝明胶置于真空烘箱中，下干燥。用分析天平测得接枝产物质量，并计算接枝率。接枝明胶的反应物配方如表所示。表 接枝明胶的反应物配方样品序号明胶 抗菌性水凝胶的制备称取 接枝明胶置于烧杯中，加入 蒸馏水在 水浴中溶解，溶解产物倒入 孔板培养皿中，轻微震荡使水凝胶在培养皿中铺平，冷却至室温水凝胶固定。然后，将培养皿放入超低温冰箱冷冻 后取出，置于真空冷冻干燥机内，冷冻干燥 完全除去水凝胶中的水分，获取孔隙状 接枝明胶。最后，取适量冻干样品准确称量后浸入 浓度为 的碘水中，避光溶胀，得到抗菌性明胶水凝胶。取出水凝胶，用滤纸吸干样品中的碘水，以便进行抗菌性实验测试。并对溶胀后剩余的碘水体积进行测量，按碘量滴定法获取碘水浓度，计算水凝胶的碘负载量。第 期 宜春学院学报 第 卷 测试表征 明胶及 接枝明胶的结构测定明胶及 接枝明胶的结构采用傅里叶红外光谱仪的 模式直接测试。红外光谱仪分辨率为，扫描次数为。接枝分率的测定系列接枝反应产物的接枝分率 按公式（）计算：（）接枝共聚物的质量明胶的质量明胶的质量（）接枝明胶水凝胶的凝胶强度测定将接枝明胶配制成浓度为 的溶液，装入 孔板，制备直径为、厚度为左右的水凝胶样品。采用流变仪的平行板测量系统，在样品 或 下，保持频率 ，应变为 进行动态时间扫描。接枝明胶后的细胞毒性测定将各样品用不含血清的培养基浸提，取出浸提液，用 的无菌滤头过滤。准备 的细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入 孔板中，每孔 放入孵箱培养至细胞贴壁。吸出孔板中的培养基，重新加入 用完全培养基稀释的不同浓度浸提液（、），放入孵箱继续孵育、天，每隔一天换一次液。孵育完后，每孔加入 溶液（），继续孵育，弃掉孔中液体，每孔加入 二甲基亚砜，震荡 ，用酶标仪检测 处的吸光度值，按常规方法计算细胞活性。水凝胶碘负载量的测定系列水凝胶的碘负载量 按公式（）计算：（）剩余碘水体积碘水浓度 接枝明胶的质量（）接枝抗菌水凝胶的抗菌性培养皿和牛津杯清洗干净并在 高压灭菌后，将营养琼脂移入无菌培养皿中。吸取 金黄色葡萄球菌液滴入平板中央，用无菌涂布器将菌液均匀地涂布在平板上。取牛津杯直径大小的抗菌性水凝胶圆片放置在平板中央，轻轻按压使其与平板完全接触。另取一只处理好的牛津杯置于平板中（与水凝胶保持一定距离），轻轻按压使之与平板紧密贴合，用移液枪移取无菌水滴入牛津杯中作为空白对照。培养皿置于 恒温箱中培养 后取出，观察水凝胶抑菌效果，并对比水凝胶的形态变化分析其形态稳定性。结果与讨论 接枝明胶的结构分析图是系列 接枝明胶和纯明胶的红外光谱对照图。从图中可见，相对于纯明胶，所有接枝了 的明胶在波数 处出现明显吸收，该峰是 中 键伸缩振动产生的强吸收。由于在索氏抽提器中回流时已经将明胶中裹挟的未接枝在明胶骨架上的 自由分子去除了，因此红外分析的结果证明了通过本文的接枝反应，明胶骨架上引入了 支链。考察吸收峰强度，随着 浓度从增加到 ，吸收峰强度呈现先增大后减小的趋势，浓度为 时特征峰强度最大，这与 的接枝分率有关。图不同 浓度制备的明胶 接枝聚合物的红外谱图 浓度对 接枝分率的影响图 浓度对 接枝分率的影响 作为亲水性聚合物分子，在明胶上的接枝分率会直接影响明胶基体在人体温度使用时的润湿性能、凝胶强度及碘负载后基体的温度稳定性。通过调节接枝反应中单体的浓度可调控 的接枝分率，结果如图所示。图中曲线显示 浓度由增加到 ，接枝分率逐渐增大至最大值 ，再继续增大 浓度，接枝分率反而降低，变化趋势与红外测试结果中 特征峰强度变化趋势一致。这是因为在水中，单体除了参与接枝明胶的反应，还会自身均聚产生游离于水中的 大分子。当 第 期杨明涛，田珊珊，吴志军，等：明胶基抗菌水凝胶的制备与表征第 卷单体浓度增大时，接枝反应速率增大，接枝分率提高，但当 浓度高至一定程度，水中均聚反应速率增大的程度大于接枝反应，接枝分率反而减小。接枝率对 接枝明胶水凝胶强度的影响图显示了 （室温）下不同 接枝分率对明胶基体储能模量的影响。由图可见，相对于纯明胶，明胶少量接枝 其储能模量减小，凝胶强度降低。但接枝分率达到 以上时，储能模量与纯明胶相当。原因是因为亲水性大分子 少量接枝于明胶减少了水凝胶中明胶的比率，即水凝胶中明胶固含量减小导致水凝胶强度降低。但当 接枝分率很高时，虽然明胶的固含量减小，但大量的 接枝链使明胶分子间的交联缠结作用大大增强，弥补了明胶固含量减小造成的凝胶强度的损失。而且对比测试发现这种接枝链的缠结作用对凝胶强度的贡献在温度比较高时尤其重要。图所示为 下接枝率对明胶基体储能模量的影响，由图中曲线可见，接枝分率越高凝胶强度越低，且都远远低于纯明胶的凝胶强度，说明此时的凝胶强度主要取决于凝胶中固含量的大小。图 接枝分率对明胶基体储能模量的影响（）图 接枝分率对明胶基体储能模量的影响（）接枝明胶的细胞毒性图是不同 接枝量下明胶水凝胶的细胞活性实验结果。由图可以看出，细胞在接枝分率为 的明胶样品浸取液中经天孵育后，浓度以下存活率都超过了 ，没有毒性。当接枝分率为 时，明胶的毒性可能来源于接枝反应中单体加入量少导致大量引发剂偶氮二异丁腈的残留。而接枝分率为 时，明胶的毒性则可能是因为对接枝样品进行抽提过程中引入了三氯甲烷，干燥过程中由于大量 存在导致了溶剂的少量残留。第 期 宜春学院学报 第 卷图 不同 接枝含量（，）下明胶水凝胶的细胞活性随浸提液浓度及孵育时间（，和）的变化趋势 接枝分率对明胶基体负载碘的影响接枝了 的明胶在碘水中浸泡，碘分子将与 发生络合，从而使明胶水凝胶可以以化学键合的方式负载碘分子。图所示为 碘水浸泡了不同接枝分率的明胶后的颜色变化图片，由图可见浸泡过接枝明胶后，碘水颜色明显变浅，说明碘负载在了明胶水凝胶中。但经不同 接枝量的明胶接触后，碘水颜色变浅的程度相当，这是由于经冷冻干燥后孔隙结构的明胶本身对碘分子具有物理吸附作用，虽然 接枝含量可提高碘分子在水凝胶中的化学键合量，但明胶分子含量减小降低了碘分子在水凝胶中的物理吸附量，因此碘分子总负载量变化不是很明显。表中列出了不同 接枝量下明胶的碘负载量，数据显示当接枝分率从 增加到 时，化学键合量的增加与物理吸附量的降低基本持平，总负载量基本不变。当接枝分率增大到 后，总负载量反而稍稍降低，说明明胶含量大大降低时，物理吸附作用的降低程度将超过化学键合作用的增加。表 不同 接枝量下明胶的碘负载量接枝分率（）碘负载量（基体）图 碘水浸泡了不同 含量的明胶颜色对比第 期杨明涛，田珊珊，吴志军，等：明胶基抗菌水凝胶的制备与表征第 卷 水凝胶的抗菌性能碘分子的负载赋予了明胶水凝胶抗菌性能。图是不同接枝分率的明胶水凝胶负载碘分子后与无菌水在培养基上的菌斑对比图。由图可见三种水凝胶周围都出现了明显的抑菌圈，说明均有较强的抑菌性，这与不同接枝率明胶的碘负载量测试结果是一致的。图 不同接枝分率的水凝胶的抑菌效应观察不同水凝胶在培养基上的状态，在 下放置 后，明胶水凝胶并没有流动蔓延到培养基其它部位。本实验工作中另外还做了一组明胶空白对照，结果发现在 下纯明胶水凝胶样品在培养基上发生溶解，变成流动态铺在了整个培养基平板上导致金黄色葡萄糖球菌死亡。这说明碘在接枝 链上的化学键合是必要的，因为相对于碘分子的物理吸附作用，它不仅引入了具有抑菌作用的碘分子，同时还增强了水凝胶在较高温度下的形态稳定性，这种形态稳定性可能来源于碘分子的化学络合作用使接枝 链之间产生了交联点，从而使明胶水凝胶内部产生交联网络。结论通过明胶接枝 后负载碘分子成功制备了明胶基抗菌水凝胶；明胶接枝 的反应中，在固定温度及引发剂浓度的条件下，将 单体的浓度从 提高到 时接枝率先增大后减小，浓度为 时，接枝分率最大；的接枝分率影响水凝胶的凝胶强度，室温时相对于纯明胶，接枝率