美洲大蠊提取物CⅡ-3调控...3蛋白抑制K562细胞增殖_何思悦.pdf

基金项目国家自然科学基金项目（81860038；81660731；81873103）收稿日期2022-08-09修回日期2022-09-03第一作者简介何思悦，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。*通信作者：周玥，教授，博士，E-mail：。慢性髓细胞性白血病（chronic myelogenousleukemia，CML）是一种恶性骨髓增生性肿瘤，占成人白血病发病率的 15%。目前酪氨酸激酶抑制剂是靶向治疗的主要方式，但治疗过程中易出现多种不良反应和副作用，对患者的治疗和生活造成极大的影响1。近年来，中药在白血病治疗方面的作用得到广泛关注，中药在抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、联合放化疗、逆转多药耐药等方面效果显著2。美洲大蠊 Periplaneta americana L.隶属蜚蠊科，古时多用于创伤修复、祛腐生肌、清热解毒等，现研究发现美洲大蠊具有增强免疫力、抗病毒等多种药理活性，对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制作用，而且原材料丰富，容易获取，应用前景广泛。有研究3-4表明，通过不同提取方法得到的多种美洲大蠊提取物对K562 细胞的增殖有不同程度的抑制作用，但具体机制尚不清楚。美洲大蠊提取物 C-3 是提取于美洲大蠊的一种小分子肽5，主要通过抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管的生成及转移、免疫调节、逆转多药耐药等方面发挥其抗癌作用6。本研究探究美洲大蠊提取物 C-3 对人白血病细胞 K562 增殖的影响，为开发低毒有效的抗肿瘤药物提供实验基础。1材料与仪器1.1材料美洲大蠊提取物 C-3 由大理大学药学院张成桂教授提供；K562 细胞（齐式生物科技有限公司）；RPMI1640 培养基（美仑生物公司，批号：C0039）；胎牛血清（Vivacell 公司，批号：2025067）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（北京索莱宝科技公司，批号：P1003）；细胞周期检测试剂盒（KeyGEN BioTECH 公司，批号：KGA512）；磷酸化p53 抗体（Abcam 公司，批号：ab32132）；羊抗兔抗体（Sigma 公司，批号：40839）；ECL 增强化学发光检测试剂盒（PIERCE 公司，批号：32209）。1.2仪器多功能酶标仪（BIO-RAD 公司）；高压蒸气灭菌器（Sanyo 公司）；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；二氧化碳培养箱（Sanyo 公司）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；倒置显微镜（Motic 公司）；细胞计数板（上海医用仪器厂）；流式细胞仪（Beckman 公司）；垂直板电泳转移装置（BIO-RAD 公司）；图像分析系统（LabworksTM美洲大蠊提取物 C-3 调控 p53 蛋白抑制 K562 细胞增殖何思悦1，唐紫云1，刘衡2，张成桂2，周雯1，毕子莹1，周玥1*（1.大理大学基础医学院，云南大理671000；2.大理大学药学院，云南大理671000）摘要目的：探讨美洲大蠊提取物 C-3 对人白血病细胞 K562 增殖的影响。方法：以不同浓度的美洲大蠊提取物 C-3 作用于 K562 细胞，CCK-8 法检测其对细胞增殖的影响，集落形成实验检测其对细胞增殖能力的影响，流式细胞术检测 K562 细胞的细胞周期，蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化 p53 蛋白的表达。结果：美洲大蠊提取物 C-3 可抑制 K562 细胞增殖，其最佳作用浓度为 80 g/mL，作用时间 72 h；C-3 能降低 K562 细胞集落形成率；使阻滞在 G0/G1 期的 K562 细胞比例增高，S 期的细胞比例减少；促进磷酸化 p53 蛋白表达上调。结论：C-3 通过调控 p53 蛋白抑制 K562 细胞增殖。关键词美洲大蠊提取物；C-3；K562 细胞；增殖；细胞周期；p53 蛋白中图分类号R285文献标志码A文章编号2096-2266（2023）02-0019-05DOI10.3969/j.issn.2096-2266.2023.02.003大理大学学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY第8卷第2期2023年2月Vol.8No.2Feb.202319Analysis Software 公司）。2实验方法2.1细胞培养用RPMI1640 培养基（含 10%胎牛血清）于 37、5%CO2培养箱中培养 K562 细胞，培养 23 d 计数并传代，取对数生长期细胞进行后续实验。2.2CCK-8 法检测细胞增殖活性取对数生长期的 K562 细胞，以 1105个/mL 的密度将细胞接种于96 孔板内，每孔 100 L，实验组分别加入终浓度为5、10、20、40、80、160 g/mL 的 C-3，每孔 50 L，每个浓度设置 3 个复孔，并设空白对照组（仅有K562 细胞，不加 C-3，以下简称“对照组”），置于37、5%CO2培养箱内分别培养 24、48、72 h，加入10 L CCK-8 溶液，孵育 2 h，酶标仪测定 450 nm波长处的吸光度（OD）值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（对照组 OD 值-实验组 OD值）/（对照组 OD 值-空白组 OD 值）100%，其中，空白组仅有培养基，用于消除计算时培养基内酚红对 OD 值的影响。2.3细胞集落形成实验收集对照组细胞和经80g/mL C-3 处理 72 h 的细胞并计数，以 1103个/mL的密度接种于 24 孔板内，每孔 500 L，每组设置 3个复孔，于培养箱内孵育 7 d，倒置显微镜下观察并计数细胞集落数，以细胞数50 为 1 个集落，计算细胞集落形成率和细胞集落抑制率。细胞集落形成率（%）=（细胞平均集落数/每孔加入的细胞数）100%；细胞集落抑制率（%）=（对照组细胞集落数-实验组细胞集落数）/对照组细胞集落数 100%。2.4流式细胞术分析细胞周期收集对照组细胞和经 80 g/mL C-3 处理 72 h 的细胞，预冷 PBS洗涤，加入 1 mL 75%乙醇吹打混匀，4 固定过夜。1 000 r/min 离心后收集细胞，PBS 洗涤，加入碘化丙啶染色液，37 避光温浴 30 min，流式细胞仪测定488 nm 波长处荧光强度。2.5蛋白质印迹法检测磷酸化 p53 蛋白表达收集对照组细胞和经 80 g/mL C-3 处理 72 h 的细胞，PBS 洗涤，加入蛋白裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取 20 g 蛋白进行上样。经电泳分离后转移至 PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭 1 h，加入一抗磷酸化 p53（1500 稀释），4 孵育过夜，TBST 缓冲液洗涤条带 3 次，加入二抗（11 000 稀释）孵育1.5 h，ECL 曝光液显色后凝胶成像系统采集图像，测定蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达量。2.6统计分析采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料以（xs）表示，P0.05 为差异有统计学意义。3结果3.1C-3 对 K562 细胞增殖的影响CCK-8 法检测结果显示：24、48、72 h 时，不同浓度的 C-3对 K562 细胞的增殖均有抑制作用，随着作用时间延长，大多数浓度 C-3 对 K562 细胞增殖抑制作用增强，因此，选择 72 h 作为培养时间。在作用时间为 72 h 时，C-3 浓度为 80 g/mL，细胞增殖抑制率最高，与大多数作用浓度和作用时间相比，差异有统计学意义（P0.05）。见表 1。因此，选择 80 g/mL C-3 作用 72 h 进行后续实验。表 1C-3 对 K562 细胞增殖的抑制率（%，xs，n=3）注：在作用时间相同的情况下，与 80 g/mL C-3 比较*P0.05；C-3浓度为80 g/mL时，与作用72 h比较P0.05。3.2C-3 对K562 细胞集落形成能力的影响与对照组相比，80 g/mL C-3 作用于 K562 细胞 72h 后，实验组细胞集落数明显减少，细胞集落形成率显著降低，差异有统计学意义（P0.01）。见表 2、图 1。3.3C-3 对 K562 细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，80 g/mL C-3 作用于 K562 细胞 72 h 后，G0/G1 期细胞比例明显升C-3 浓度/（g/mL）518.20.639.11.3*54.51.41022.40.633.01.2*49.11.9*2017.41.922.24.0*39.01.6*4037.30.5*46.30.8*44.91.5*8021.22.954.91.157.81.016024.40.846.30.3*43.53.0*24 h48 h72 h大理大学学报总第 86 期自然科学20组别细胞集落数/个细胞集落形成率/%细胞集落抑制率/%对照组472.36.194.51.2实验组297.36.5*59.51.3*37.11.4*4讨论CML 是一种起源于造血干细胞的骨髓增生性疾病，化疗是目前临床上主要治疗方案，但化疗所导致的副作用极大地影响患者的治疗效果和生活质量7。因此，寻找高效、低毒副作用的药物成为治疗的新目标8。高，S 期细胞比例显著降低，差异有统计学意义（P0.01）。见表 3、图 2。3.4C-3 对 K562 细胞磷酸化 p53 蛋白表达的影响蛋白质印迹法结果显示，与对照组相比，80 g/mLC-3 作用 72 h 后，磷酸化 p53 蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P0.01）。见图 3。组别G0/G1 期S 期G2/M 期对照组17.243.30275.422.1597.331.232实验组29.950.975*62.441.457*7.600.524注：与对照组相比*P0.01。表 3C-3 对 K562 细胞周期的影响（%，xs，n=3）注：A 为对照组，B 为实验组；第 1 个峰为 G0/G1 期，第 2 个峰为 G2/M 期，平台为 S 期。图 2C-3 对 K562 细胞周期的影响相对细胞数相对细胞数50040030020010005004003002001000306090120306090120荧光信号相对强度荧光信号相对强度AB注：A 为对照组，B 为实验组。图 1C-3 对 K562 细胞集落形成能力的影响（100）AB100m100m表 2C-3 对 K562 细胞集落形成能力的影响（xs，n=3）注：与对照组相比*P0.01。何思悦，唐紫云，刘衡，等美洲大蠊提取物 C-3 调控 p53 蛋白抑制 K562 细胞增殖总第 86 期第 8 卷21高三尖杉酯碱是从我国特有植物粗榧中提取的一种生物碱，研究9表明其具有抗肿瘤活性，对K562 细胞有抑制增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期等作用，在临床治疗中，广泛用于治疗急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征，2012 年被美国食品药品监督管理局批准用于治疗伊马替尼耐药的 CML 患者，由此可见中药在白血病治疗方面有着很大的潜力。美洲大蠊，古时称蜚蠊，其药用价值最早在 神农本草经 中记载，具有活血散瘀的功效10。有研究11结果表明，美洲大蠊在抗肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等方面疗效显著，有着良好的应用前景。研究3表明，美洲大蠊提取物对 K562 细胞、人原髓细胞白血病 HL-60 细胞和小鼠淋巴样瘤P388D1 细胞的生长均有抑制作用。本研究中，CCK-8法测定结果显示，美洲大蠊提取物 C-3 浓度为 80g/mL、作用 72 h 时，对 K562 细胞增殖抑制率最高，为（57.81.0）%，故选择此浓度及作用时间进行后续实验。集落形成实验可以直观地反映肿瘤细胞的群体依赖性和增殖能力12，经 80 g/mL C-3作用 72 h 的 K562 细胞其集落形成能力明显下降，以上结果说明 C-3 能够抑制 K562 细胞增殖。细胞增殖依赖于正常的细胞周期进程，包括G0/G1 期、S 期、G2 期、M 期 4 个时期，癌细胞的细胞周期调节失调，细胞无限增殖分裂13，这种异常的细胞周期进程是导致肿瘤发生的基本机制之一14。处于 G0