木犀草素通过TLR4_NF...径对哮喘模型幼鼠炎症的影响_刘克新.pdf

黑龙江医学2023年1月25日第47卷第2期HEILONGJIANG MEDICAL JOURNALJan.25,2023Vol.47No.2论著哮喘是一种常见的气道炎症性疾病，以反复阻塞气道为特征，与黏液分泌过多和气道炎症细胞浸润有关。目前，全球哮喘患者超过3亿多人，且数量逐年上升1。目前治疗哮喘的方法主要是使用吸入皮质类固醇、长效2抑制剂等药物。但目前关于哮喘的治疗过程中，部分治疗的疗效不确定，且因药物的副作用，患者依从性比较差2。因此有必要探究新的药物控制哮喘的症状。Toll 样受体（Toll-like receptors 4，TLR4）是一种模式识别受体，研究报道OVA激活Toll样受体通路及其下游靶点核因子B 蛋白（Nuclear Factor Kappa-B，NF-B），引起Th2相关哮喘炎症反应的加重和炎症细胞因子基因表达，NF-B是一种多细胞转录因子，在调节炎症和免疫反应中也起着重要作用3。抑制NF-B可以减轻卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘4。木犀草素（Luteolin，LT）以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道症状咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关，如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与局部的炎症浸润有木犀草素通过TLR4/NF-B途径对哮喘模型幼鼠炎症的影响刘克新1，龚本新2，何飞雪1，黎胜年1，郑英1，雷华凤11.中国科学院大学深圳医院（光明）东院区儿科，广东深圳518000；2.中国科学院大学深圳医院（光明）妇幼保健部，广东深圳518000摘要 目的：探究木犀草素（luteolin，LT）通过 TLR4/NF-B 途径对 OVA 诱导幼鼠哮喘模型的炎症的影响。方法：将40只SD雌性小鼠随机分为正常组、模型组、木犀草素组。小鼠通过第1 d、7 d腹腔注射卵清蛋白的乳化液，第15 d、16 d、17 d、18 d、19 d雾化吸入含3%OVA的生理盐水，建立哮喘模型。第15 d，LT组每天腹腔注射1 mg/kg、2mg/kgLT；模型组、正常组注射等体积生理盐水。第30 d采用小鼠无创肺功能仪检测小鼠气道高反应，ELISA测血清IL-2、IL-4浓度，HE染色观察肺组织炎症变化，RT-PCR检测肺组织TLR4、NF-B的RNA表达，免疫印迹检测肺组织TLR4/NF-B pP65蛋白表达。结果：木犀草素组的气道高反应和血清IL-4浓度低于模型组，血清IL-2浓度高于模型组。与模型组比，肺组织中，木犀草素组肺部炎症改善，木犀草素组TLR4、NF-B的mRNA和蛋白表达低于模型组。结论：木犀草素通过调控TLR4/NF-B途径抑制幼鼠哮喘模型的炎症反应。关键词木犀草素；下游靶点核因子B蛋白；哮喘；幼鼠；炎症doi10.3969/j.issn.1004-5775.2023.02.001学科分类代码320.2415中图分类号R562.2+5文献标识码BEffects of Luteolin on Inflammation via TLR4/NF-B Pathway in Young Rats in an Asthma Model/LIU Ke-xin,GONG Ben-xin,HE Fei-xue,et al./Department of Pediatrics,East Campus of Shenzhen Hospital(Guangming),University of Chinese Academy of Sciences,Shenzhen Guangdong,518000,ChinaAbstract Objective:To investigate the effect of luteolin(LT)on inflammation via the TLR4/NF-B pathway in an OVA-induced asthma model in young rats.Methods:40 SD female pups were randomly divided into normal group,model group,and lignocaine group.The asthma model was established in rats by intraperitoneal injection of emulsion of ovalbumin on day 1 and 7,andnebulized inhalation of saline containing 3%OVA on day 15,16,17,18 and 19.On the 15th day,1 mg/kg and 2 mg/kg lignocainewere injected in the lignocaine group,and equal volumes of saline were injected in the model and normal groups,respectively.Onthe 30th day,the airway hyperresponsiveness of mice was detected by non-invasive lung function instrument,serum IL-2 and IL-4concentrations were measured by ELISA,inflammatory changes in lung tissues were observed by HE staining,RNA expression ofTLR4 and NF-B in lung tissues was detected by RT-PCR,and TLR4/NF-B pP65 protein expression in lung tissues was detectedby immunoblotting.Results:The airway hyperresponsiveness and serum IL-4 concentrations were lower in the lignocaine groupthan in the model group,and serum IL-2 concentrations were higher than in the model group.Compared with the model group,inlung tissue,lung inflammation was improved in the lignocaine group,and mRNA and protein expression of TLR4 and NF-B werelower in the lignocaine group than in the model group.Conclusion:Lignocaine suppresses inflammatory responses in a youngmouse asthma model by modulating the TLR4/NF-B pathway.Keywords Luteolin;Downstream target nuclear factor-B protein;Asthma;Young rat;Inflammation133黑龙江医学2023年1月25日第47卷第2期HEILONGJIANG MEDICAL JOURNALJan.25,2023Vol.47No.2关。炎症的存在使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反应性增高，治疗的手段首先应该消除气道的慢性炎症浸润。目前常用糖皮质激素消除气道炎症，但糖皮质激素的副作用较多，不宜长期应用。研究表明，LT抑制巨噬细胞磷酸化，抑制转录因子NF-kB的活性，能够抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6，TNF-。后两种细胞因子在炎症机制中扮演非常重要的角色，是反映炎症程度的敏感指标。LT 还能提高 IFN-，降低特异性IgE，减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外，LT除了抗炎、抗过敏作用以外，还具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性，其原因为抑制SARS病毒前S蛋白的活性，从而阻止其进入宿主细胞。LT用于治疗COPD、支气管哮喘、慢性咽炎以及变应性鼻炎等引起的慢性咳嗽。LT是一种具有抗炎作用的天然黄酮类化合物，具有抗炎和自由基清除作用5，目前研究发现LT能减轻过敏性小鼠支气管收缩和气道高反应性调节，但对LT通过TLR4相关途径的哮喘尚无研究。因此，本研究探讨木犀草素是否可以通过抑制TLR4/NF-B途径诱导抑制哮喘模型的炎症。1实验材料1.1实验动物选择 SPF 级 SD 雌性幼年小鼠 40 只，4 周龄，体重（10020）g。广东省实验动物中心提供，饲养深圳大学SPF动物房。1.2主要试剂和仪器木犀草素（中国MCE公司），卵清蛋白（哈尔滨百杰斯生物公司），大鼠血清IL-2、IL-4 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所），RevertAid First Strand Cdna美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司，PowerUp SYBRTMGreen Master MIX 美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司，兔抗大鼠TLR4抗体（美国abcam公司），兔抗大鼠NF-B p65抗体（美国abcam公司），兔抗大鼠GAPDH抗体（美国abcam公司），HRP-羊抗兔IgG抗体（美国abcam公司），超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司）。2实验方法2.1哮喘造模将幼年小鼠适应性饲养3 d之后，除去正常组幼鼠10只，剩余30只幼鼠在第1 d、7 d腹腔注射卵清蛋白和氢氧化铝预混制备的乳化液共1 mL（100 mg氢氧化铝和1 mg卵清蛋白）。第15 d、16 d、17 d、18 d、19 d分别给予雾化吸入含3%OVA的生理盐水 20 min，正常组以及生理盐水代替卵清蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。2.2药物干预OVA干预造模小鼠组随机分为3组，分别是哮喘模型组、LT低浓度组、LT高浓度组，每组10只小鼠。LT低浓度组、LT高浓度组均从第1次哮喘激发开始（造模第15 d），每只每天分别予1 mg/kg，2 mg/kg腹腔注射，以上各组连续给药14 d后，然后把小鼠处死进行实验研究。2.3实验标本采集第30 d，进行幼鼠眼眶取血，静置15 min后，4，3 000 r/min，离心10 min，取上层血清，保存于-80 冰箱中；开胸取出左上肺组织，冷冻于液氮中；取出右上肺组织，放入4%多聚甲醛固定。2.4小鼠气道高反应检测采用小鼠无创肺功能仪检测小鼠气道高反应情况，按照肺功能仪检测步骤，使用不同剂量（0 g/mL、6.25 g/mL、12.50 g/mL、25.00 g/mL、50.00 g/mL、100.00 g/mL）乙酰甲胆碱激发后，检测各组小鼠气道高反应。2.5血清IL-2、IL-4含量测定取冻存的血清，采用ELISA方法检测各组大鼠血清IL-2、IL-4的浓度，具体实验方法根据ELISA试剂盒说明书操作，绘制标准曲线，计算IL-2、L-4浓度。2.6肺组织病理切片炎症观察将右上肺从4%多聚甲醛中取出，进行常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，封片，显微镜下观察肺组织炎症情况。2.7肺组织TLR4、NF-bpP65的RNA表达从NCBI库查找大鼠TLR4、NF-B 基因，根据基因设计TLR4、NF-B，取每组左上肺组织，放入液氮中充分研磨，按照 RNA 提取试剂盒说明书，提取 RNA。测量RNA浓度，根据RevertAid First Strand cDNA试剂盒，转录成 CDNA；根据 PowerUp SYBRTM Green Master MIX 试剂盒操作步骤，上机检测TLR4、NF-B的